Arquitectura molecular y conservación de un retrovirus endógeno humano inmaduro.

Nature Communications volumen 14, número de artículo: 5149 (2023) Citar este artículo

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El retrovirus K endógeno humano (HERV-K) es el retrovirus endógeno adquirido más recientemente en el genoma humano y se activa y expresa en muchos cánceres y en la esclerosis lateral amiotrófica. Presentamos la estructura inmadura de la cápside de HERV-K con una resolución de 3,2 Å determinada a partir de partículas similares a virus nativos mediante tomografía crioelectrónica y promediado de subtomogramas. La estructura muestra una unidad de hexámero oligomerizada a través de un haz de 6 hélices, que está estabilizada por una pequeña molécula análoga a IP6 en la cápside inmadura del VIH-1. La red inmadura de HERV-K se ensambla a través de interfaces de dímeros y trímeros altamente conservados, como se detalla a través de simulaciones de dinámica molecular de todos los átomos y respaldado por estudios mutacionales. Durante la maduración de HERV-K se produce un gran cambio conformacional mediado por el conector entre los dominios N-terminal y C-terminal de CA. La comparación entre HERV-K y otras estructuras de cápside inmaduras retrovirales revela un mecanismo altamente conservado para el ensamblaje y maduración de retrovirus en todos los géneros y tiempos evolutivos.

Cuando se secuenció por primera vez el genoma humano, se descubrió que ~8% puede clasificarse en la amplia clase de retrovirus endógenos humanos (HERV)1. Estos virus se integraron en el genoma durante millones de años y la mayoría ha acumulado mutaciones que los hacen no infecciosos. HERV-K (HML-1 a HML-10) es el grupo de virus más activo y de incorporación más reciente, especialmente su subgrupo HML-2. HERV-K está presente con cientos de copias en el genoma y algunas copias de HERV-K consisten en un marco de lectura abierto completo con todas las proteínas estructurales y reguladoras presentes, pero ninguna puede completar un ciclo de vida viral debido a mutaciones en algunas proteínas. Si bien HERV-K no se expresa en células adultas sanas, algunos loci están regulados positivamente en varios cánceres2,3,4,5,6, en la esclerosis lateral amiotrófica (ELA)7, durante la infección por VIH-18 y, más recientemente, en órganos y tejidos. de primates y ratones ancianos9,10. Cuando las copias de HERV-K se expresan en estas células, pueden producir partículas similares a virus (VLP) que no son infecciosas. Sin embargo, se demostró que una secuencia consenso basada en diez provirus de longitud completa de HERV-K, denominada KERV-Kcon, produce viriones infecciosos11,12, cuyo ciclo de vida está inhibido por una variedad de factores de restricción como la teterina y los miembros de la familia APOBEC que restringir los retrovirus exógenos. Por lo tanto, HERV-K sirve como paradigma para la comprensión de la arquitectura y las propiedades de los retrovirus endógenos cuando se integraron en el genoma humano hace miles de años. Constituyen un registro fósil guardado en nuestros genomas y proporcionan un patrón de conservación que ha evolucionado a lo largo de millones de años de interacción entre los retrovirus y sus huéspedes. Además, HERV-K también es de importancia médica ya que las VLP de HERV-K inducen senescencia en células jóvenes10 y varios genes están bajo control transcripcional definido por los loci de HERV-K durante la tumorigénesis13.

Filogenéticamente, HERV-K pertenece al supergrupo similar a betaretrovirus ya que su secuencia es más similar a la del virus del tumor mamario de ratón (MMTV)14,15. La principal proteína estructural Gag es suficiente para que HERV-K produzca VLP inmaduras. Tras la maduración, Gag es escindido por su proteasa en matriz (MA, se une a la membrana), p15, cápside (CA, forma el núcleo interno), nucleocápside (NC, se une al ARN) y tres péptidos espaciadores (SP1, QP1 y QP2). 16,17. La estructura madura de la cápside de HERV-K se dilucida recientemente mediante crioEM de partícula única, utilizando ensamblajes in vitro de proteína de la cápsida (CA) 18 de HERV-Kcon recombinante. Sin embargo, la estructura inmadura de HERV-K Gag y su ensamblaje como una red inmadura siguen siendo difíciles de alcanzar.

Aquí presentamos un estudio crioET de las VLP nativas inmaduras de HERV-Kcon Gag liberadas de células humanas. Curiosamente, las VLP de HERV-Kcon Gag son mucho más grandes que otros retrovirus conocidos, con un espacio sustancialmente mayor entre la membrana y la capa de la cápside. Utilizamos crioET y promedio de subtomograma (STA) para determinar la estructura del dominio HERV-K CA de Gag inmaduro con una resolución de 3,2 Å. Su estructura general es análoga a la de otros retrovirus, lo que demuestra una fuerte conservación entre los retrovirus endógenos y exógenos humanos. Si bien los dominios individuales N-terminal (NTD) y C-terminal (CTD) de la cápside se conservan estructuralmente entre las formas madura e inmadura, la bisagra entre estos dos dominios, sin embargo, es diferente, lo que lleva a orientaciones NTD y CTD muy diferentes. y, en consecuencia, redes distintas para el HERV-K maduro e inmaduro. La presencia de una densidad conservada en la parte superior del haz de 6 hélices (6HB) del hexámero CA inmaduro, coordinada por dos anillos de residuos de lisina conservados, sugiere un mecanismo notablemente similar de los hexafosfatos de inositol (IP6) en el ensamblaje de HERV-K y infección en comparación con IP6 en VIH-1 y otros retrovirus como EIAV y RSV19,20,21.

Para comparar la morfología de HERV-K con virus exógenos, expresamos las VLP de HERV-Kcon (en adelante HERV-K para simplificar) en células HEK293T y las purificamos con una ultracentrifugación en gradiente de densidad final (Figura complementaria 1a). Había dos bandas que contenían VLP en el gradiente, que luego se congelaron por inmersión por separado en etano líquido para el análisis crioET. La banda superior tenía muchas VLP fusionadas (Figura complementaria 1b, panel III), mientras que la banda inferior consistía principalmente en VLP individuales bien formadas, adecuadas para el análisis estructural. Estas VLP tienen forma esférica, contienen una bicapa lipídica externa y un anillo interno para la red CA (Fig. 1a-c). El diámetro de las VLP de HERV-K varía de 120 nm a 210 nm con un diámetro medio de ~ 173 nm (Fig. 1e), significativamente más grande que otros retrovirus, incluidos VIH-1 y VIH-2, RSV, MLV, HTLV- 1 y HFV22. En comparación con las VLP inmaduras del VIH-1, parece una brecha más amplia entre la bicapa lipídica y la red de la cápside (Fig. 1c, d). Además, medimos la distancia entre la membrana y CA, lo que resultó en una distancia de separación que oscilaba entre 16 nm y 24 nm con un valor medio de 21 nm, mucho mayor que la separación en el VIH-1 (~10 nm)22, pero cercana a la brecha en RSV (~ 18 nm) 22 (Fig. 1f).

a Representación esquemática de los dominios Gag. b – d Imágenes crioEM representativas de VLP de HERV-K inmaduras purificadas con aumentos bajos (b), medianos (c) y altos (d). e La media (línea roja) y la distribución (barras grises) del diámetro (flecha roja en d) de las VLP de HERV-K, en comparación con los diámetros medios de otros retrovirus (líneas azules). f La media (línea morada) y la distribución (barras grises) de la distancia entre la bicapa lipídica y la red de la cápside (púrpura en d) de las VLP de HERV-K, en comparación con la distancia media de otros retrovirus (líneas azules). Las micrografías en (b) y (c, d) son representativas de 20 y 124 mediciones, respectivamente. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

La mayor distancia entre la red de CA y la membrana probablemente se deba a la presencia de los segmentos SP1 y p15 entre MA y CA. P15 codifica un motivo de dominio tardío (L) que es necesario para el reclutamiento de proteínas del huésped responsables de la liberación de viriones de la membrana plasmática16,17. VIH-1, VIH-2 y HTLV-1 no tienen dominios adicionales entre MA y CA. MMTV tiene 4 proteínas (pp21, p3, p8, n) sin un dominio tardío pero se requieren p8 y n para el ensamblaje23. M-PMV, RSV y MLV codifican cada uno segmentos adicionales entre MA y CA (pp24(L)/p12; p2a/p2b(L)/p10(L); p12(L) respectivamente)24,25,26,27,28 y, en consecuencia, muestran una brecha mayor en comparación con el VIH-122,29. La gran distancia observada entre la membrana y la red de CA en HERV-K se correlaciona bien con la presencia de estos segmentos adicionales entre MA y CA.

Las VLP de HERV-K inmaduras son heterogéneas con tamaños y morfologías variables (Fig. 1), por lo que empleamos crioET combinado con STA para determinar la estructura de la red de CA inmadura. Los centroides de ~800 VLP se detectaron computacionalmente a partir de los tomogramas de manera automatizada y se usaron como semillas para encontrar la ubicación de la superficie externa de la red de CA utilizando rutinas de segmentación no supervisadas. Se identificaron posiciones distribuidas uniformemente de 270 K a lo largo de la red CA de todas las VLP y se extrajeron subvolúmenes con una longitud lateral de 40 nm para su posterior procesamiento (Figura complementaria 2a). El promedio del subtomograma seguido del análisis de las proyecciones de la serie de inclinación sin procesar utilizando procedimientos de refinamiento de STA que imponen las restricciones de la geometría de inclinación, dio como resultado un mapa de resolución de 3,2 Å (Fig. 2a, Fig. complementaria 2b). El mapeo de subtomogramas individuales a los tomogramas originales revela que las posiciones refinadas de los subtomogramas están dispuestas en una red hexagonal con espacios incorporados para acomodar la curvatura de la red (Figura complementaria 3). Este tipo de red CA inmadura hexagonal se observa en muchos otros retrovirus y parece ser una característica conservada en todos los géneros retrovirales. Por tanto, es probable que haya evolucionado antes de la integración de HERV-K en el genoma humano. El promedio del subtomograma pudo resolver el dominio CA de Gag (secuencia de aminoácidos 283–532 de Gag) y no se observó una densidad bien resuelta para MA o NC. Las cadenas laterales en el mapa STA de CA inmaduro de HERV-K se resolvieron claramente (Fig. 2a, Fig. Suplementaria 2b, d), lo que permitió la construcción de modelos atómicos (Fig. 2b). El monómero CA consta de un dominio N-terminal con 7 hélices y un dominio C-terminal formado por hélices 8-11 y una hélice terminal 12 (Fig. 2c, d). El vínculo entre las NTD y el CTD también está bien resuelto. Los primeros 21 aminoácidos en el extremo N son flexibles y no se incluyeron en el modelo atómico.

un mapa CryoET STA del hexámero HERV-K CA inmaduro coloreado mediante resolución local (de rojo a azul). b Una losa del mapa de hexámero de HERV-K CA superpuesta con el modelo atómico (colores del arco iris de azul a rojo, del extremo N al extremo C). c El modelo atómico del monómero inmaduro de HERV-K CA (NTD en azul, CTD en naranja , h12 en rojo) con hélices α marcadas. d El modelo atómico del hexámero inmaduro de HERV-K visto desde el costado y desde arriba con un monómero coloreado en azul y naranja. e Una porción central del mapa de densidad del hexámero de HERV-K, que muestra la densidad IP6 con un IP6 instalado (flecha roja) y dos anillos Lys (K166 y K240), además del núcleo hidrofóbico del 6HB (M244 e I248). f, g Losas de densidad en la parte superior (f, cuadro punteado superior) en e) y la parte inferior (g, cuadro punteado inferior en e) del 6HB, con las cadenas laterales que sobresalen mostradas como palos. h El dímero (círculo negro) y el trímero (círculo rojo) interactúan entre hexámeros inmaduros adyacentes de HERV-K. i Una vista detallada de la interfaz del trímero que involucra la hélice 4 con las cadenas laterales contribuyentes mostradas como barras. j Una vista detallada de la interfaz del dímero que involucra la hélice 9 con las cadenas laterales involucradas mostradas como barras.

Al igual que otras estructuras CA inmaduras retrovirales, no hay interfaces de interacción NTD-CTD presentes dentro del hexámero29. Los monómeros de CA se ensamblan en un hexámero a través de las hélices terminales h12, formando el 6HB (Fig. 2d). En la parte superior del 6HB, hay una fuerte densidad, que probablemente corresponde a la molécula de mioinositol hexakisfosfato (IP6) de 647,94 Da, coordinada por dos anillos de residuos de lisina, K166 y K240 (Fig. 2e, f), notablemente similares. al hexámero CA inmaduro en VIH-1, donde la molécula IP6 neutraliza las cargas de dos anillos de lisina, K158 y K227, estabilizando así el 6HB30. Más abajo en el 6HB, los residuos hidrofóbicos en la cara interna del 6HB facilitan la formación del haz (Fig. 2e, g). El ensamblaje de la red de CA inmadura está mediado principalmente por las interacciones hidrofóbicas en las interfaces del trímero (hélice h4 N-terminal) y del dímero (hélice h9 C-terminal) entre hexámeros adyacentes (Fig. 2h-j). En contraste, el virus del mono Mason-Pfizer (M-PMV), la única estructura inmadura resuelta en la familia de los betaretrovirus, no muestra el haz de 6 hélices en el extremo C ni en la interfaz del trímero N-terminal31. Sin embargo, la presencia de la unión CA-NC del M-PMV sigue siendo esencial para el ensamblaje, la maduración y la infectividad31. Como HERV-K se ensambla en la membrana plasmática2, a diferencia de otros betaretrovirus que se ensamblan en el citoplasma, el 6HB podría ser una característica que se perdió en algunos betaretrovirus en algún momento durante la evolución viral.

Antes de realizar simulaciones de dinámica molecular, construimos y refinamos un modelo de estructura del hexámero HERV-K CA mediante modelado comparativo utilizando RosettaCM32 (Figura complementaria 4). El modelo refinado se utilizó para ensamblar y realizar simulaciones de dinámica molecular para probar la integridad estructural y la estabilidad general de las interacciones formadas en las interfaces trímeras y dímeras de la red hexamérica HERV-K CA (Figura complementaria 5), así como para probar el intradominio. Interacciones entre los monómeros individuales. Por lo tanto, se perfeccionó un modelo inicial susceptible de simulaciones atomísticas a partir de los datos de densidad como se describe en la sección de métodos a continuación y siguiendo un procedimiento desarrollado previamente por Dick et al.33.

Las fluctuaciones cuadráticas medias de los átomos pesados (RMSF) se derivaron de las simulaciones para determinar la flexibilidad de los aminoácidos ubicados en múltiples interfaces CA. Las interacciones interfaciales de residuos también se identificaron midiendo las distancias de residuo a residuo desde la trayectoria de simulación. Específicamente, las interacciones de puentes salinos se caracterizaron por la distancia entre los átomos que interactúan, mientras que para las interacciones hidrófobas se midió la distancia entre el centro de masa y el centro de masa de los átomos pesados de la cadena lateral. La flexibilidad es un buen indicador de la importancia y especificidad de los contactos, ya que los contactos más rígidos tienden a ser más esenciales para la estabilidad de una interfaz; al mismo tiempo, los residuos más flexibles tienden a tener distribuciones de distancias de interacción más extendidas, lo que indica interacciones fluctuantes y ocupaciones más bajas. Por ejemplo, inicialmente identificamos que R100 y Q118 (ubicados en h4) son los residuos más flexibles en la interfaz del trímero entre hexámeros, caracterizados por los valores más altos de RMSF (Fig. 3a-c). Debido a esta flexibilidad, Q118 formó periódicamente interacciones de enlaces de hidrógeno con R100 mientras también interactuaba con el solvente (Fig. 3a, Fig. Suplementaria 6a). Además, R100 también formó interacciones hidrofóbicas con S121 y T122 (Fig. 3a, Fig. Suplementaria 6a). Probamos el efecto de la supresión de carga mediante mutación de alanina en estos residuos midiendo la eficiencia de la producción de VLP mediante transferencias Western. Estos resultados fueron consistentes con su capacidad para retener el ensamblaje cuando mutaron y demostraron que la naturaleza química de estos residuos no es esencial para la formación de la interfaz trimérica (Fig. 3g).

a – c Instantáneas de la interfaz del trímero entre hexámeros que involucra la hélice 4 con las cadenas laterales contribuyentes mostradas como palos. Los residuos en (b) y (c) muestran interacciones estables. d Una instantánea de la interfaz del dímero entre hexámeros que involucra la hélice 9 con las cadenas laterales contribuyentes. e, f Vistas del 6HB con las cadenas laterales contribuyentes del núcleo hidrofóbico (M244 e I248) (e) y los anillos K166 y K240 con la molécula IP6 (f). En cada instantánea, la proteína se representa como una caricatura (NTD en azul, CTD en naranja). Las cadenas laterales de los aminoácidos se colorean según el RMSF de átomos pesados calculado durante la simulación MD. g Western-blot del conjunto de VLP que porta mutantes de interfaz trímero de HERV-K Gag. Los experimentos de transferencia Western, incluidas infecciones independientes, se repitieron tres veces. Los datos de origen para (g) se proporcionan como un archivo de datos de origen.

Se encontraron interacciones estables en la interfaz trimérica entre hexámeros dominada por residuos cargados y complementados por residuos hidrófobos ubicados en h4. Se demostró que las interacciones hidrofóbicas en la interfaz del trímero entre hexámeros entre L82 y W87 proporcionan estabilización a la interfaz del trímero (Fig. 3c, Fig. complementaria 6c). Una inspección más cercana reveló que L82 formó grupos hidrofóbicos inespecíficos entre sí y con W87 (Figura complementaria 6c). Los residuos cargados R97, E69, K85 y D90, así como el residuo hidrófobo Y66, se identificaron como no flexibles según sus bajos valores de RMSF (Fig. 3b). En consecuencia, su densidad está bien resuelta en el mapa crio-ET en comparación con los residuos flexibles en la interfaz del trímero interhexámero (Figura complementaria 7). Encontramos que R97 formó interacciones de puentes salinos con E69 e interacciones amino-aromáticas con Y66 (Fig. 3b, Fig. Suplementaria 6b); y K85 formó una interacción de puente salino con D90 (Fig. 3b, Fig. complementaria 6b). La eliminación de carga de cada uno de estos residuos por separado, además de cambiar el residuo aromático, elimina por completo la producción de VLP (p. ej., mutaciones a alanina) (Fig. 3g). Los resultados confirman el papel estabilizador de estos aminoácidos en la interfaz del trímero entre hexámeros en el ensamblaje inmaduro de HERV-K Gag.

En la interfaz del dímero entre hexámeros pudimos confirmar interacciones hidrofóbicas entre h9, similares a otros retrovirus. En promedio, los residuos en la interfaz del dímero entre hexámeros eran menos flexibles en comparación con los residuos en la interfaz del trímero entre hexámeros con la excepción de L196 (Fig. 3d, Fig. Suplementaria 6d). Además, V192 interactuó con L196 y periódicamente con I193 o M197 (Figura complementaria 6e), mostrando posibles ocupaciones parciales de V192. También observamos que E135 formó interacciones de puentes salinos con R98 (Figura complementaria 6f). Además, observamos la formación de puentes salinos entre el E132 de hexámeros vecinos mediados por iones de sodio (Figura complementaria 6g), de acuerdo con las regiones de densidad no proteica observadas en el mapa crio-ET cerca de los residuos de E132 (Figura complementaria .8).

Al monitorear la flexibilidad de la cadena lateral en las interacciones intrahexaméricas, confirmamos la mala estabilidad de las interacciones hidrofóbicas entre los anillos de M244 e I248 en el 6HB (Figura complementaria 6h). Esta falta de estabilidad fue captada por su mayor flexibilidad en comparación con K166 y K240 (Fig. 3e, f). La adición de moléculas IP6 a la cavidad de los anillos hexaméricos estabilizó los anillos K166 y K240 mediante la formación de interacciones de puentes salinos (Figura complementaria 6i). Se observó que los anillos K166 y K240 eran más flexibles en ausencia de las moléculas IP6, como se refleja en el aumento de las desviaciones cuadráticas medias (RMSD) en comparación con los hexámeros con moléculas IP6 unidas (Fig. 3e, f, Fig. complementaria 9). . Además, se encuentra que la molécula IP6 es estable en el 6HB, según lo medido por un RMSF bajo en los átomos del anillo de carbono, mientras que los oxígenos en los grupos fosforilo son los más flexibles (Figura complementaria 10), de acuerdo con la densidad observada. .

Al comparar la forma inmadura de HERV-K CA con su contraparte madura18, se muestra claramente que NTD y CTD por separado se superponen casi perfectamente y el número de hélices y sus orientaciones en los dominios separados no cambia, excepto por la adición de h12 en la estructura inmadura (Fig. 4a) (tenga en cuenta que la numeración de hélices difiere de Acton et al.18 para cumplir con otros retrovirus donde la hélice 9 forma la interfaz CTD-CTD). Sin embargo, la bisagra entre los dominios en la CA inmadura adopta una conformación completamente diferente a la de la forma madura, lo que resulta en una orientación diferente entre el NTD y el CTD y, en consecuencia, ni las interfaces diméricas ni las triméricas son iguales. Esto es análogo a la diferencia conformacional observada entre el CA maduro y el inmaduro en el VIH-119.

a Superposición de la estructura inmadura de HERV-K (azul NTD, naranja CTD, rojo h12) con HERV-K maduro (gris, PDB: 6SSM), alineada con NTD (izquierda), CTD (centro) y NTD/CTD por separado (bien). b, c Disposición de las redes inmaduras (b) y maduras (c) de HERV-K. NTD está coloreado en azul/cian, CTD en naranja/rojo. d, e Vistas detalladas de la interfaz del dímero (arriba) y del trímero (abajo) en las redes inmadura (d) y madura (e).

En la red inmadura, NTD y CTD están ubicados uno encima del otro, lo que hace imposible formar interacciones entre los dos dominios. Esto le da un esquema de empaquetamiento más ajustado y alargado verticalmente que la red madura (Fig. 4d, e). El empaquetamiento apretado permite que el virus forme un conjunto completamente nuevo de interacciones en su red, incluido el 6HB (Fig. 4b), la interfaz del dímero y la interfaz del trímero (Fig. 4b-e). La interfaz del dímero en el HERV-K inmaduro es muy similar a la del M-PMV, aunque más extensa en comparación con el VIH-1, especialmente en lo que respecta al NTD19. Al igual que el VIH-1, las interacciones diméricas CTD-CTD de HERV-K están formadas por la hélice 9 tanto en la estructura inmadura como en la madura. Si bien algunas de las cadenas laterales que interactúan, A189, V192 e I193, se conservan18, los ángulos de cruce de h9, sin embargo, son muy diferentes (-50° inmaduro frente a 95° maduro), lo que da como resultado una interfaz general diferente. La similitud entre HERV-K y VIH-1 en las interfaces inmaduras y en la diferencia conformacional entre la CA madura y la inmadura sugiere un probable proceso de maduración estructural conservado34,35.

Estructuralmente, la disposición de los dominios CA en HERV-K inmaduro intacto es más similar a la de M-PMV y RSV inmaduros, pero se desvía de la de VIH-1 y MLV inmaduros (Fig. 5a). Esta diferencia en la orientación del dominio CA se había observado previamente entre M-PMV y VIH-119. Al comparar HERV-K con VIH-1, las secuencias de las hélices terminales en VIH-1 y HERV-K son sorprendentemente similares (Figura complementaria 11). Tanto HERV-K como VIH-1 se unen a IP6 mediante dos anillos de lisina19 (Fig. 5d). RSV, un alfaretrovirus, se une a IP6 en una bolsa similar, pero a través de un anillo de lisinas y un anillo de argininas20. Mientras que HERV-K, VIH-1, MLV y M-PMV usan su hélice 9 para formar una interfaz dimérica en el CTD, MLV forma interacciones adicionales entre su hélice 3/10 y la base de h936. Otros retrovirus utilizan interfaces diméricas adicionales en el NTD, de modo que MLV involucra la hélice 7 y el bucle entre la hélice 4 y 536, RSV forma su interfaz dimérica usando las hélices 2 y 7 y necesita su región aguas arriba p10 para formar la red CA37, mientras que VIH- 1 requiere H1/H2 para formar las interfaces diméricas/triméricas en el NTD29.

a Superposición de las estructuras monoméricas de CA inmaduras de HERV-K (NTD azul, CTD naranja, h12 rojo) con las de otros retrovirus (gris) alineadas con el NTD, se muestran M-PMV (PDB: 6HWI, beta-retrovirus), RSV (PDB: 5A9E, alfa-retrovirus), VIH-1 (PDB: 7ASL, lentivirus), MLV (PDB: 6HWW, gamma-retrovirus). b Estructuras hexámeras de M-PMV, RSV, VIH-1 y MLV. c Árbol filogenético basado en estructura. d – f Conservación de interfaces intermoleculares de CA inmaduras, en comparación con VIH-1 (interfaz hexámero, d), RSV (interfaz trímero, e) y MLV (interfaz dímero, f). La estructura de HERV-K está coloreada en azul y naranja, otros retrovirus en gris.

Se puede utilizar un árbol filogenético basado en la estructura para clasificar los modelos de proteínas por su similitud sin tener en cuenta su secuencia de aminoácidos. Esto permite realizar comparaciones que no estén sesgadas sobre qué tan estrechamente relacionados están dos virus. Un árbol basado en estructuras inmaduras publicadas nos permite ver similitudes que de otro modo no serían obvias (Fig. 5c). Una comparación con el HERV-K CA maduro puede explicar por qué se encuentra más alejado de su forma inmadura, aunque obviamente tiene la misma secuencia de aminoácidos que su forma inmadura.

Sin embargo, sorprendentemente, el betaretrovirus inmaduro, M-PMV, no se sitúa junto al modelo inmaduro HERV-K. Tiene un NTD similar al de HERV-K, que se puede ver en la similitud de la interfaz trimérica. Sin embargo, sus hélices en el CTD difieren significativamente; y, como ya se mencionó, carece de la hélice h12 en el extremo C que forma el 6HB en los otros retrovirus (Fig. 5b). Vale la pena mencionar que el MPMV es un betaretrovirus “tipo D”, distinto del MMTV y otros betaretrovirus. Se considera que el RSV, un alfaretrovirus, tiene la relación más cercana con el HERV-K. De hecho, se superpone bien en ambos dominios y su interfaz trimérica también se forma de manera similar (Fig. 5e). Incluso con estas similitudes, los ensamblajes cuaternarios difieren entre los dos virus, incluido el 6HB. MLV está situado en el otro extremo del árbol, lo que puede explicarse porque no se superpone bien en su CTD ni en su NTD (Fig. 5a). La relación distante de MLV también se ha caracterizado al comparar formas maduras18. Curiosamente, entre todos los retrovirus inmaduros, las interfaces diméricas se conservan, incluso en comparación con el MLV distante (Fig. 5f).

El estudio de la estructura de un virus endógeno proporciona información sobre la arquitectura de los virus endógenos cuando se integraron en el genoma. HERV-K se considera un virus endógeno joven ya que algunas copias se integraron hace <1 millón de años38. Una comparación de la estructura de HERV-K CA con la de virus exógenos muestra en qué se diferencian. Sin embargo, como aquí se utiliza la secuencia consenso de HERV-K, que es una aproximación del grupo HERV-K, podrían ser posibles pequeñas desviaciones, especialmente si se considera que los virus endogenizados podrían haber resultado de una selección de valores atípicos más propensos a la endogenización. . No obstante, se conserva la arquitectura general del virus inmaduro. Curiosamente, se recluta una pequeña molécula huésped para ayudar al ensamblaje de HERV-K inmaduro de la misma manera que los otros retrovirus, lo que sugiere una característica distintiva de los retrovirus inmaduros en todos los géneros y tiempos evolutivos. La aparente conservación estructural refuerza la idea de que los procesos de ensamblaje y maduración entre retrovirus implican mecanismos similares.

Paul Bieniasz proporcionó amablemente el consenso del gen HERV-K gag/pol HERV-Gag-PR-Pol11. Las transfecciones se realizaron en células HEK293T (ECACC) con el plásmido consenso HERV-K Gag utilizando GeneJet como recipiente. Las VLP se recolectaron 48 h después de la transfección girando a baja velocidad y filtrando el sobrenadante para eliminar restos celulares grandes. Luego, el sobrenadante se cubrió con OptiPrep al 8 % (Sigma-Aldrich) en tampón STE (NaCl 100 mM, Tris-Cl 10 mM, pH 8,0, EDTA 1 mM; Sigma-Aldrich) como cojín y se centrifugó a 100.000 g, 4°. C durante 1:20 h. El sedimento se hizo girar en gradientes OptiPrep del 10 %, 20 % y 30 % a 120.000 g, 4 °C durante 2:30 h. Las bandas de VLP se extrajeron con una jeringa y se sedimentaron nuevamente en STE a 160.000 g, 4 °C durante 1:20 h para eliminar OptiPrep residual. A continuación se resuspendió el sedimento en líquido residual.

Las VLP se mezclaron con fiduciales de oro de 6 nm. La congelación por inmersión se realizó con una Leica GP2 secando desde el lado sin carbono. La muestra se aplicó sobre rejillas de carbón de encaje, malla 300 Cu (Agar Scientific), se secó durante 3 segundos y se sumergió en etano líquido. Las rejillas se proyectaron en una Talos Arctica.

La recolección de datos se realizó en un Titan Krios equipado con un filtro de energía Selectris (Thermo Fisher Scientific). El tamaño del píxel se estableció en 1,5 Å, la exposición en 1,17 s, una dosis total de 127,5 electrones/Å2 y un ancho de rendija de 5 eV. Las series de inclinación se recopilaron con un esquema de inclinación simétrica de dosis utilizando un rango de +/-60° y un tamaño de paso de 3°.

Se alinearon y reconstruyeron 124 series de inclinación utilizando rutinas automatizadas implementadas en el paquete IMOD39. Los modelos CTF astigmáticos por inclinación se estimaron utilizando parámetros geométricos obtenidos del proceso de alineación de series de inclinación40. Para seleccionar las posiciones correspondientes a la proteína Gag, primero se seleccionaron manualmente las VLP de cada tomograma en 3D. El radio de cada VLP se estimó y guardó junto con sus coordenadas del centro xyz. La segmentación de volumen a lo largo de la red CA de baja densidad se realizó de forma semiautomática utilizando superficies geodésicas mínimas41,42. Se generaron posiciones distribuidas uniformemente muestreadas a lo largo de la red CA manteniendo una distancia mínima entre unidades de 96 Å. Utilizando esta estrategia, se seleccionaron 274.994 posiciones de partículas de la segmentación de 794 VLP y se extrajeron los subvolúmenes correspondientes para su posterior análisis. El promedio de subvolumen ab-initio se realizó utilizando EMAN243, seguido de un refinamiento de alta resolución utilizando tomografía de partícula única restringida (CSPT)40,44. Después de varias rondas de orientación de partículas y refinamiento de la geometría de inclinación, se eliminaron las partículas duplicadas y de baja calidad, lo que dio como resultado 188.111 partículas limpias que se utilizaron para producir la reconstrucción final de Gag inmaduro con una resolución de 3,2 Å. La resolución se estimó utilizando la correlación de Fourier Shell (FSC) de medio mapa utilizando el criterio de corte de 0,143. El mapa EM final y las coordenadas atómicas se mapearon nuevamente en los tomogramas utilizando el complemento ArtiaX45 con las orientaciones de partículas obtenidas durante el refinamiento de CSPT42.

Construimos y refinamos un modelo de estructura del hexámero HERV-K CA antes de las simulaciones MD mediante modelado comparativo utilizando RosettaCM32 de acuerdo con el siguiente procedimiento.

Primero, la estructura crioET STA del hexámero HERV-K CA fue un cuerpo rígido colocado por separado en la densidad usando el software UCSF Chimera46 versión 1.17 generando un mapa de densidad simulado aproximado inicial con una resolución de 8 Å, ajustándolo a la densidad experimental crioET y luego aumentando secuencialmente la resolución del mapa de densidad simulado a 4 Å y 2 Å y luego ajustándolo nuevamente. Además, se seleccionó y utilizó la densidad experimental de crioET dentro de 2 Å del hexámero HERV-K CA y se utilizó para refinar la estructura. Además, se extrajo un monómero de CA ajustado de la estructura ajustada y se utilizó como plantilla para el modelado comparativo guiado por densidad.

A continuación, la secuencia de aminoácidos de HERV-K CA se insertó en el monómero plantilla. Además, seis cadenas del modelo roscado se volvieron a colocar en la densidad crioET del hexámero y se usaron para generar definiciones de simetría para su uso en Rosetta, restringiendo las cadenas adyacentes para mantener una simetría C6 NCS.

Luego se utilizó RosettaCM para refinar el modelo utilizando la densidad de crioET mediante la realización de tres pasos de optimización: en primer lugar, se generaron y optimizaron estructuras de novo para los bucles faltantes en el ángulo de torsión y el espacio de coordenadas cartesianas mediante muestreo de Monte Carlo. En segundo lugar, los bucles generados se unieron a las estructuras muestreadas del modelo de plantilla realizando un muestreo de Monte Carlo en el espacio de coordenadas cartesianas, optimizando la geometría de la columna vertebral y las interacciones de los enlaces de hidrógeno de la columna vertebral. En el paso final, las cadenas laterales de la estructura completa se optimizaron geométricamente en el espacio de coordenadas cartesianas minimizando la función de energía de todos los átomos de Rosetta47. Los tres pasos utilizaron el término de puntuación de densidad elec_dens_fast con pesos de 10, 10 y 50, respectivamente. Además, se habilitó la puntuación simétrica y la optimización en todos los pasos. La última función de puntuación de densidad de todos los átomos utilizó los pesos talos_2014. Los tres pasos de optimización se manejaron en un solo procedimiento utilizando el motor hibridizador en la versión 2021.16.61620 de los scripts de Rosetta.

En total, generamos de forma independiente 800 modelos utilizando este procedimiento y se seleccionó el modelo superior con la energía potencial más baja medida por la función de energía de todos los átomos de Rosetta47 como estructura inicial para las simulaciones de MD.

La calidad de la estructura refinada se cuantificó utilizando el servidor MolProbity48, que evalúa la consistencia estructural de los enlaces, ángulos, diedros y rotámeros de una estructura proteica en comparación con sus valores esperados experimentalmente49,50. Aunque la estructura inicial sin refinar contenía abundancia de choques estéricos con átomos a distancias inferiores a 0,4 Å, así como conformaciones atípicas para los enlaces, ángulos, diedros y rotámeros, el refinamiento geométrico tanto en el espacio de ángulos cartesianos como en los de ángulos de torsión nos permite obtener una estructura con Choques mínimos, aumentando el porcentaje de diédricos y rotámeros favorecidos y reduciendo el número de valores atípicos estructurales mientras se conserva la estructura secundaria general y es consistente con la densidad de crioET. Como resultado, nuestro modelo refinado logra una puntuación MolProbity más baja como se resume en la Tabla complementaria 1 y se ajusta bien a la densidad calculada por las puntuaciones Q51 (Figura complementaria 12). El modelo resultante se presenta en la figura complementaria 4.

El modelo atómico del hexámero HERV-K CA que se generó utilizando el software Rosetta basado en la densidad crioET se utilizó como modelo inicial para las simulaciones de MD (Figura complementaria 5a). El hexámero CA modelado se usó para generar un motivo hexámero de hexámeros (HOH) (seis hexámeros alrededor de un hexámero central) ajustando cada hexámero modelado en la densidad crioET usando el software UCSF Chimera46 (Figura complementaria 5b). Acoplamos las moléculas IP6 entre los anillos Lys166 y Lys240 en cada hexámero utilizando la herramienta Autodock Vina52 implementada en el software UCSF Chimera. Colocamos cien iones de cloruro y cincuenta iones de sodio cerca de los hexámeros usando el complemento Cionize en el software VMD53 versión 1.9.4a57. Además, solvatamos el sistema resultante con moléculas de agua TIP3P54 y agregamos iones de sodio y cloruro adicionales para lograr una concentración de sal de 150 mM usando el complemento autoionizante en VMD53 (Figura complementaria 5c). Por lo tanto, el modelo HOH preparado con solvente tenía la granilaridad de resolución de todos los átomos necesaria para cuantificar la estabilidad de la estructura a nivel de residuo e identificar interacciones electrostáticas, de enlaces de hidrógeno e hidrofóbicas. El dominio de simulación final contenía ≈1.250.000 átomos con un tamaño total del sistema de ≈312 Å × 303 Å × 140 Å. Se generó un sistema sin moléculas IP6 siguiendo el mismo protocolo de configuración y tenía un tamaño de sistema similar como se detalla en la Tabla complementaria 2.

Sometimos los dominios de simulación HOH resultantes en presencia y ausencia de moléculas IP6 al mismo protocolo de simulación. Al principio, los dominios de simulación se sometieron a minimización en dos pasos utilizando el software de simulación NAMD2.1455. En el primer paso de minimización, fijamos la proteína y las moléculas de IP6 mientras que las moléculas de solvente fueron minimizadas en energía usando el esquema de gradiente conjugado hasta que el gradiente convergió a valores por debajo de 10 kcal mol-1 Å-1. En el segundo paso, se liberaron las restricciones sobre la proteína y las moléculas de IP6 y se minimizó la energía de todo el sistema durante 100.000 pasos utilizando el esquema de gradiente conjugado. Cada paso de minimización fue seguido por la termalización del dominio de simulación durante la cual el sistema se calentó de 50 K a 310 K en incrementos de 5 K durante 0,5 ns. Durante el segundo paso de termalización, aplicamos restricciones posicionales a los átomos pesados de la columna vertebral de los hexámeros y a los átomos pesados de las moléculas de IP6 con una constante de fuerza de 10 kcal mol-1 Å-1. Posteriormente, realizamos simulaciones de dinámica molecular durante las cuales las restricciones posicionales se eliminaron gradualmente a una velocidad de 1 kcal mol-1 Å-1 por 0,2 ns, desde 10 kcal mol-1 Å-1 hasta 0 kcal mol-1 Å-1 durante 2 ns. Luego, los sistemas se equilibraron durante 2 ns. Realizamos las dos últimas simulaciones en el conjunto NPT mientras la temperatura se mantenía a 310 K con una constante de acoplamiento de 1 ps-1 usando el termostato Langevin y la presión se mantenía a 1 atm con parámetros de período y decaimiento establecidos en 100 ps y 50 ps, respectivamente, utilizando el barostato Nose-Hoover. Durante las simulaciones de equilibrio, se permitió que gridForces56,57 mantuviera el conjunto HOH general y evitara la difusión de los monómeros individuales en el disolvente utilizando la densidad crioET experimental.

Después de realizar el equilibrio de los dominios de simulación, realizamos simulaciones de producción de los sistemas HOH. Aplicamos las restricciones posicionales de 1 kcal mol-1 Å-1 a los átomos de Cα en la columna vertebral proteica de los segmentos helicoidales en cada hexámero. Se utilizaron condiciones de contorno periódicas en todas las simulaciones con un paso de tiempo de 2 fs. Las interacciones electrostáticas se calcularon utilizando el método de Ewald de malla de partículas con un límite para las interacciones electrostáticas de corto alcance establecido en 12 Å. Realizamos todas las simulaciones utilizando el campo de fuerza CHARMM36m58 para proteínas, los parámetros del campo de fuerza para IP6 se generaron utilizando CGenFF59,60, los parámetros del campo de fuerza de Roux para iones61 y el modelo de agua TIP3P54. Generamos 200 ns de datos para cada uno de los sistemas HOH en presencia y ausencia de las moléculas IP6.

Analizamos las interacciones formadas entre aminoácidos en las interfaces trímeras y dímeras establecidas por los hexámeros vecinos, así como las interacciones intradominio. Para los residuos en las interfaces de dímeros entre hexámeros y trímeros entre hexámeros, su fluctuación cuadrática media y los contactos con otros residuos en la interfaz se recolectaron en las 12 interfaces de dímeros y 6 interfaces de trímeros, respectivamente, mientras que las distancias de interacción y las fluctuaciones cuadráticas medias Para los residuos de la interfaz intrahexámero se recolectaron de las 7 unidades de hexámero en el conjunto HOH, los valores informados son promedios estadísticos de todas las copias de un residuo en una interfaz determinada y, por lo tanto, son promedios de réplicas independientes con diferentes coordenadas iniciales. Las interacciones hidrófobas se capturaron calculando las distancias entre centros de masa y centros de masa entre los átomos pesados de las cadenas laterales de los aminoácidos que interactúan, mientras que las interacciones de puentes salinos se definieron como las distancias entre los átomos que interactúan.

Las mutaciones se introdujeron diseñando cebadores directos y inversos que incluían la mutación deseada y luego realizando una PCR usando Pfr Turbo y restringiendo el plásmido original con DpnI a 37 °C. Las secuencias de cebadores se proporcionan en el archivo de datos de origen. Las mutaciones se confirmaron mediante secuenciación (cebador directo: TCAAGAAAGGAAGGAGATACTGAG). Las transfecciones se realizaron como se explica en la sección de preparación de VLP pero con 10 veces menos células al principio. Se utilizó el plásmido HERV-Kcon como control positivo y no se utilizó ningún plásmido como control negativo. El sobrenadante se centrifugó a baja velocidad, se filtró y se sedimentó sobre un cojín OptiPrep al 8% a 150.000 g durante 1 h. El sobrenadante se pasó sobre un gel SDS y luego se transfirió a una membrana. La membrana se bloqueó con leche desnatada al 5 % y luego se incubó con el anticuerpo primario HERV-K Gag (dilución 1:5000, HERM-1841-5) durante la noche a 4 °C. La membrana se lavó previamente para la incubación con el anticuerpo secundario anti-HRP de ratón (dilución 1:5000, A0168 Sigma-Aldrich) durante una hora a temperatura ambiente y se tomaron imágenes con las soluciones de sustrato Clarify Western ECL (Bio-Rad). Para ver un ejemplo de transferencias de escaneo completo, consulte el archivo de datos fuente adjunto.

El árbol filogenético basado en la estructura se realizó utilizando SHP62,63, como se especifica en64. Se utilizaron los siguientes archivos pdb: 6SSM (HERV-K maduro)18, 7ASL (HIV-1 inmaduro)30, 6HWW (MLV inmaduro)36, 6HWI (M-PMV inmaduro)36, 5A9E (RSV inmaduro)37, este HERV -K modelo inmaduro. Si los archivos pdb contenían más de una cadena, solo se usaba un monómero y los monómeros se alineaban previamente en Chimera para colocarlos en el mismo sistema de coordenadas antes de ejecutar SHP. La alineación de la secuencia de aminoácidos se realizó utilizando la herramienta en línea Clustal Omega y la coloración de los aminoácidos se realizó utilizando MView65.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen del informe de Nature Portfolio vinculado a este artículo.

Todos los datos necesarios para evaluar las conclusiones del artículo están presentes en el artículo y/o la información complementaria y los datos originales se proporcionan con este artículo. Los mapas de densidad promedio del subtomograma crioET y los modelos atómicos correspondientes se han depositado en EMDB y PDB, con códigos de acceso EMD-16511 y PDB ID 8C9M, respectivamente. Los códigos PDB de estructuras publicadas anteriormente utilizadas en este estudio son 6SSM (HERV-K maduro), 7ASL (VIH-1 inmaduro), 6HWW (MLV inmaduro), 6HWI (M-PMV inmaduro) y 5A9E (RSV inmaduro). Los datos originales se proporcionan con este documento.

Todos los archivos de entrada y scripts utilizados para el refinamiento del modelo y la simulación de dinámica molecular, así como las coordenadas iniciales y finales de la trayectoria analizada, se han depositado en el repositorio público Zenodo [https://doi.org/10.5281/zenodo.8180645].

Lander, E., Linton, L., Birren, B. y Nusbaum, C. Secuenciación inicial y análisis del genoma humano. Naturaleza 409, 860–921 (2001).

Artículo CAS PubMed ADS Google Scholar

García-Montojo, M., Doucet-O'Hare, T., Henderson, L. y Nath, A. Retrovirus K endógeno humano (HML-2): una revisión exhaustiva. Crítico. Rev. Microbiol. 44, 715–738 (2018).

Artículo PubMed PubMed Central Google Scholar

Herbst, H., Sauter, M. y Mueller-Lantzsch, N. Expresión de elementos del retrovirus K endógeno humano en células germinales y tumores trofoblásticos. Soy. J. Pathol. 149, 1727-1735 (1996).

CAS PubMed PubMed Central Google Académico

Büscher, K. y col. Expresión del retrovirus K endógeno humano en melanomas y líneas celulares de melanoma. Res. Cáncer. 65, 4172–4180 (2005).

Artículo PubMed Google Scholar

Kurth, R. & Bannert, N. Efectos beneficiosos y perjudiciales de los retrovirus endógenos humanos. Int J. Cáncer 126, 306–314 (2010).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Dervan, E., Bhattacharyya, DD, McAuliffe, JD, Khan, FH y Glynn, SA Antiguo adversario: HERV-K (HML-2) en cáncer. Frente. Oncol. 11, 658489 (2021).

Li, W. y col. El retrovirus K endógeno humano contribuye a la enfermedad de la neurona motora. Ciencia. Traducción Medicina. 7, 307ra153 (2015).

Artículo PubMed PubMed Central Google Scholar

Young, GR y cols. La infección por VIH-1 de células T CD4 + primarias regula la expresión de elementos específicos del retrovirus endógeno humano HERV-K (HML-2). J. Virol. 92, e01507–17 (2018).

Artículo PubMed Google Scholar

Autio, A. et al. Efecto del envejecimiento sobre los cambios transcriptómicos asociados con la expresión del provirus HERV-K (HML-2) en 1q22. Inmune. Envejecimiento 17, 11 (2020).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Liu, X. y col. La resurrección de retrovirus endógenos durante el envejecimiento refuerza la senescencia. Celda 186, 1-18 (2023).

Artículo de Google Scholar

Lee, YN y Bieniasz, PD Reconstitución de un retrovirus endógeno humano infeccioso. Patógeno PloS. 3, 0119–0130 (2007).

Artículo CAS Google Scholar

Dewannieux, M. y col. Identificación de un progenitor infeccioso para los retroelementos endógenos humanos de HERV-K de copias múltiples. Genoma Res. 16, 1548-1556 (2006).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Buzdin, A., Kovalskaya-Alexandrova, E., Gogvadze, E. y Sverdlov, E. Al menos el 50% de las repeticiones terminales largas de HERV-K (HML-2) específicas de humanos sirven in vivo como promotores activos para el ADN no repetitivo del huésped. transcripción. J. Virol. 80, 10752–10762 (2006).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Medstrand, P. & Blomberg, J. Caracterización de una nueva transcriptasa inversa que codifica secuencias retrovirales endógenas humanas similares a los retrovirus tipo A y tipo B: transcripción diferencial en tejidos humanos normales. J. Virol. 67, 6778–6787 (1993).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Callahan, R., Drohan, W., Tronick, S. & Schlom, J. Detección y clonación de secuencias de ADN humano relacionadas con el genoma del virus del tumor mamario de ratón. Proc. Nacional. Acad. Ciencia. Estados Unidos 79, 5503–5507 (1982).

Artículo CAS PubMed PubMed Central ADS Google Scholar

Kraus, B., Boller, K., Reuter, A. y Schnierle, BS Caracterización de la proteína K Gag del retrovirus endógeno humano: identificación de sitios de escisión de proteasa. Retrovirología 8, 21 (2011).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

George, M. y otros. Identificación de los sitios de escisión de proteasa en una poliproteína Gag reconstituida de un elemento HERV-K(HML-2). Retrovirología 8, 30 (2011).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Acton, O. y col. Base estructural de la geometría del fullereno en una cápside de retrovirus endógeno humano. Nat. Comunitario. 10, 1-13 (2019).

Artículo de Google Scholar

Dick, R. y col. Las estructuras de redes inmaduras de EIAV Gag revelan un papel conservado para IP6 en el ensamblaje de lentivirus. Patógeno PloS. 16, e1008277 (2020).

Artículo PubMed PubMed Central Google Scholar

Obr, M. et al. La estructura de la red madura del virus del sarcoma de Rous revela un papel del IP6 en la formación del hexámero de la cápside. Nat. Comunitario. 12, 1-12 (2021).

Artículo de Google Scholar

Dostálková, A. et al. Efecto de pequeños polianiones en el ensamblaje in vitro de miembros seleccionados de alfa, beta y gammaretrovirus. Virus 13, 129 (2021).

Artículo PubMed PubMed Central Google Scholar

Martin, JL, Cao, S., Maldonado, JO, Zhang, W. y Mansky, LM Morfologías de partículas distintas reveladas mediante análisis paralelos comparativos de partículas similares a retrovirus. J. Virol. 90, 8074–8084 (2016).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Zábranský, A. et al. Los dominios Gag no canónicos p8 yn son fundamentales para el ensamblaje y liberación del virus del tumor mamario de ratón. J. Virol. 84, 11555-11559 (2010).

Artículo PubMed PubMed Central Google Scholar

Sakalian, M. & Hunter, E. Dominios de transporte y ensamblaje separados dentro del precursor Gag del virus del mono Mason-Pfizer. J. Virol. 73, 8073–8082 (1999).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Gottwein, E. y col. Los motivos PPPY y PSAP del virus del mono Mason-Pfizer contribuyen a la liberación del virus. J. Virol. 77, 9474–9485 (2003).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Dilley, KA, Gregory, D., Johnson, MC y Vogt, VM Un dominio tardío LYPSL en la proteína Gag contribuye a la liberación y replicación eficiente del virus del sarcoma de Rous. J. Virol. 84, 6276–6287 (2010).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Xiang, Y., Cameron, CE, Wills, JW y Leis, J. Mapeo fino y caracterización del dominio de ensamblaje tardío Pr76gag del virus del sarcoma de Rous. J. Virol. 70, 5695–5700 (1996).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Bartusch, C. & Prange, R. Requisitos ESCRT para la liberación del virus de la leucemia murina. Virus 8, 103 (2016).

Artículo PubMed PubMed Central Google Scholar

Schur, FKM y cols. Estructura de la cápside inmadura del VIH-1 en partículas de virus intactas con una resolución de 8,8 Å. Naturaleza 517, 505–508 (2015).

Artículo CAS PubMed ADS Google Scholar

Mendonça, L. et al. Las estructuras crioET de VIH Gag inmaduro revelan un haz de seis hélices. Comunitario. Biol. 4, 481 (2021).

Artículo PubMed PubMed Central Google Scholar

Strohalmová-Bohmová, K. et al. Papel del dominio tipo péptido espaciador CA-NC del virus del mono Mason-Pfizer en el ensamblaje de partículas inmaduras. J. Virol. 88, 14148–14160 (2014).

Artículo PubMed PubMed Central Google Scholar

Song, Y. et al. Modelado comparativo de alta resolución con RosettaCM. Estructura 21, 1735-1742 (2013).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Dick, RA y cols. Los fosfatos de inositol son cofactores de ensamblaje del VIH-1. Naturaleza 560, 509–512 (2018).

Artículo CAS PubMed PubMed Central ADS Google Scholar

Ning, J. y col. La escisión de proteasas in vitro y las simulaciones por computadora revelan la vía de maduración de la cápside del VIH-1. Nat. Comunitario. 7, 13689 (2016).

Artículo CAS PubMed PubMed Central ADS Google Scholar

Krebs, AS, Mendonça, LM & Zhang, P. Análisis estructural del ensamblaje y maduración de retrovirus. Virus 14, 1-12 (2022).

Google Académico

Qu, K. et al. Estructura y arquitectura de las cápsides del virus de la leucemia murina inmaduras y maduras. Proc. Nacional. Acad. Ciencia. Estados Unidos 115, E11751–E11760 (2018).

Artículo CAS PubMed PubMed Central ADS Google Scholar

Schur, FKM, Dick, RA, Hagen, WJH, Vogt, VM & Briggs, JAG La estructura de las partículas de mordaza del virus del sarcoma de Rous similares a virus inmaduros revela un papel estructural para el dominio p10 en el ensamblaje. J. Virol. 89, 10294–10302 (2015).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Jha, AR y cols. La datación transversal de nuevos haplotipos de HERV-K 113 y HERV-K 115 indica que estos provirus se originaron en África antes que el Homo sapiens. Mol. Biol. Evolución. 26, 2617–2626 (2009).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Mastronarde, DN & Held, SR Alineación automatizada de series de inclinación y reconstrucción tomográfica en IMOD. J. Estructura. Biol. 197, 102-113 (2017).

Artículo PubMed Google Scholar

Bouvette, J. y col. Adquisición de datos acelerada por desplazamiento de imagen del haz para tomografía crioelectrónica de una sola partícula con resolución casi atómica. Nat. Comunitario. 12, 1957 (2021).

Artículo CAS PubMed PubMed Central ADS Google Scholar

Bartesaghi, A., Sapiro, G. & Subramaniam, S. Un enfoque de segmentación tridimensional basado en energía para la interpretación cuantitativa de tomogramas electrónicos. Traducción IEEE. Proceso de imagen 14, 1314-1323 (2005).

Artículo PubMed PubMed Central ADS Google Scholar

Bartesaghi, A. et al. Un nuevo enfoque para la segmentación 3D de tomografías celulares obtenidas mediante microscopía electrónica tridimensional. 2do IEEE Int. Síntoma. Biomédica. Imágenes: Macro Nano 2, 5–8 (2004).

Google Académico

Chen, M. y col. Un flujo de trabajo de procesamiento de datos completo para crio-ET y promediación de subtomogramas. Nat. Métodos 16, 1161–1168 (2019).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Bartesaghi, A., Lecumberry, F., Sapiro, G. y Subramaniam, S. Determinación de la estructura secundaria de proteínas mediante tomografía crioelectrónica restringida de una sola partícula. Estructura 20, 2003-2013 (2012).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Ermel, UH, Arghittu, SM y Frangakis, AS ArtiaX: una caja de herramientas de tomografía electrónica para el manejo interactivo de subtomogramas en UCSF ChimeraX. Ciencia de las proteínas. 31, e4472 (2022).

Artículo PubMed PubMed Central Google Scholar

Pettersen, EF y cols. UCSF Chimera: un sistema de visualización para investigación y análisis exploratorios. J. Química informática. 25, 1605-1612 (2004).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Alford, RF y cols. La función de energía totalmente atómica de Rosetta para modelado y diseño macromolecular. J. química. Computación teórica. 13, 3031–3048 (2017).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Chen, VB y cols. MolProbity: validación de la estructura de todos los átomos para cristalografía macromolecular. Acta Crystallogr. Secta. D.66, 12-21 (2010).

Artículo CAS Google Scholar

Engh, RA y Huber, R. Parámetros de ángulo y enlace precisos para el refinamiento de la estructura de proteínas por rayos X. Acta Crystallogr. Secta. A 47, 392–400 (1991).

Artículo de Google Scholar

Lovell, SC y cols. Validación de estructura mediante geometría Calpha: desviación phi,psi y Cbeta. Proteínas 50, 437–450 (2003).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Pintilie, G. y col. Medición de la resolubilidad del átomo en mapas crio-EM con puntuaciones Q. Nat. Métodos 17, 328–334 (2020).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Trott, O. & Olson, AJ AutoDock Vina: mejorar la velocidad y precisión del acoplamiento con una nueva función de puntuación, optimización eficiente y subprocesos múltiples. J. Computación. Química. 31, 455–461 (2010).

CAS PubMed PubMed Central Google Académico

Humphrey, W., Dalke, A. y Schulten, K. VMD: Dinámica molecular visual. J. Mol. Grafico. 14, 33–38 (1996).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Jorgensen, WL y Jenson, C. Dependencia de la temperatura del agua TIP3P, SPC y TIP4P de simulaciones NPT Monte Carlo: búsqueda de temperaturas de máxima densidad. J. Computación. Química. 19, 1179-1186 (1998).

3.0.CO;2-J" data-track-action="article reference" href="https://doi.org/10.1002%2F%28SICI%291096-987X%2819980730%2919%3A10%3C1179%3A%3AAID-JCC6%3E3.0.CO%3B2-J" aria-label="Article reference 54" data-doi="10.1002/(SICI)1096-987X(19980730)19:103.0.CO;2-J">Artículo CAS Google Scholar

Phillips, JC y cols. Dinámica molecular escalable con NAMD. J. Computación. Química. 26, 1781–1802 (2005).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Trabuco, LG, Villa, E., Mitra, K., Frank, J. y Schulten, K. Ajuste flexible de estructuras atómicas en mapas de microscopía electrónica mediante dinámica molecular. Estructura 16, 673–683 (2008).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Trabuco, LG, Villa, E., Schreiner, E., Harrison, CB y Schulten, K. Ajuste flexible de dinámica molecular: una guía práctica para combinar microscopía crioelectrónica y cristalografía de rayos X. Métodos 49, 174–180 (2009).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Huang, J. y col. CHARMM36m: un campo de fuerza mejorado para proteínas plegadas e intrínsecamente desordenadas. Nat. Métodos 14, 71–73 (2017).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Vanommeslaeghe, K. & MacKerell, AD Automatización del campo de fuerza general CHARMM (CgenFF) I: percepción de enlaces y tipificación de átomos. J. química. inf. Modelo 52, 3144–3154 (2012).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Vanommeslaeghe, K., Raman, EP y MacKerell, AD Automatización del campo de fuerza general CHARMM (CgenFF) II: asignación de parámetros enlazados y cargas atómicas parciales. J. química. inf. Modelo 52, 3155–3168 (2012).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Beglov, D. & Roux, B. Representación finita de un sistema masivo infinito: potencial de límite de solvente para simulaciones por computadora. J. química. Física. 100, 9050–9063 (1994).

Artículo CAS ADS Google Scholar

Stuart, DI, Levine, M., Muirhead, H. y Stammers, DK Estructura cristalina de la piruvato quinasa del músculo de gato con una resolución de 2,6 Å. J. Mol. Biol. 134, 109-142 (1979).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Ng, WM, Stelfox, AJ y Bowden, TA Desentrañar las relaciones entre virus mediante clasificación filogenética basada en estructuras. Evolución del virus. 6, veaa003 (2020).

Artículo PubMed PubMed Central Google Scholar

Pryce, R. y col. La clasificación basada en estructuras define las clases conformacionales discretas adoptadas por Arenaviral GP1. J. Virol. 93, e01048–18 (2018).

PubMed PubMed Central Google Académico

Madeira, F. y col. Servicios de herramientas de búsqueda y análisis de secuencia del EMBL-EBI en 2022. Nucleic Acids Res. 50, W276–W279 (2022).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

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Agradecemos a Paul Bieniasz por el plásmido pCRVI/Gag-PR-Pol, a Geoff Sutton y Weng Ng por su ayuda con el diagrama de árbol filogenético basado en estructuras. Agradecemos a Luiza Mendonca por su ayuda con la preparación inicial del VLP. Agradecemos a Diamond por el acceso y el apoyo a las instalaciones crio-EM en el Centro nacional de bioimagen electrónica (eBIC) del Reino Unido (propuestas NT21004 y NR21005), financiado por Wellcome Trust, MRC y BBSRC. Los aspectos de procesamiento de datos de esta investigación fueron respaldados por la subvención número 203141/Z/16/Z de Wellcome Trust Core Award y el NIHR Oxford BRC. Reconocemos el soporte computacional a través de los siguientes recursos: la Red de Innovación y Fuerza Laboral de Investigación Avanzada de Delaware (DARWIN) y el grupo Caviness. Este estudio utilizó los recursos computacionales ofrecidos por Duke Research Computing (http://rc.duke.edu). Agradecemos a Tracy Futhey, Katie Kilroy, Charley Kneifel, Mike Newton, Victor Orlikowski, Tom Milledge y David Lane de la Oficina de Tecnología de la Información y Computación de Investigación de Duke por brindar asistencia con el entorno informático. Esta investigación fue financiada por el premio Wellcome Trust Investigator Award del Reino Unido (206422/Z/17/Z) y la subvención ERC AdG (101021133), ASK contó con el apoyo de una beca Dphil de biología estructural celular de Wellcome Trust. La investigación presentada en esta publicación fue parcialmente financiada por NIAID y NIGMS de los Institutos Nacionales de Salud (R01AI157843 y R01GM141223). Este trabajo utilizó Delta en el Centro Nacional de Aplicaciones de Supercomputadoras a través de la asignación MCB170096 del programa Ecosistema de Coordinación de Infraestructura Cibernética Avanzada: Servicios y Soporte (ACCESS), que cuenta con el apoyo de las subvenciones de la Fundación Nacional de Ciencias #2138259, #2138286, #2138307, #2137603 y #2138296.

Estos autores contribuyeron igualmente: Anna-Sophia Krebs, Hsuan-Fu Liu, Ye Zhou.

División de Biología Estructural, Centro Wellcome Trust de Genética Humana, Universidad de Oxford, Oxford, OX3 7BN, Reino Unido

Anna-Sophia Krebs, Juan Shen y Peijun Zhang

Departamento de Bioquímica, Facultad de Medicina de la Universidad de Duke, Durham, NC, 27710, EE. UU.

Hsuan-Fu Liu y Alberto Bartesaghi

Departamento de Ciencias de la Computación, Universidad de Duke, Durham, Carolina del Norte, 27708, EE. UU.

Ye Zhou y Alberto Bartesaghi

Departamento de Química y Bioquímica, Universidad de Delaware, Newark, DE, 19716, EE. UU.

Juan S. Rey, Lev Levintov & Juan R. Perilla

Fuente de luz Diamond, Campus de Ciencia e Innovación de Harwell, Didcot, OX11 0DE, Reino Unido

Andrew Howe y Peijun Zhang

Departamento de Ingeniería Eléctrica e Informática, Universidad de Duke, Durham, NC, 27708, EE. UU.

Alberto Bartesaghi

Academia China de Ciencias Médicas Instituto Oxford, Universidad de Oxford, Oxford, OX3 7BN, Reino Unido

Pei Jun Zhang

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ASK y PZ concibieron el proyecto. ASK produjo y purificó VLP de HERV-K, preparó la muestra crioET con la ayuda de JSAH y recopiló los datos de la serie de inclinación de la tomografía. HFL e YZ promediaron el subtomograma. JSR, LL y JRP produjeron las simulaciones de dinámica molecular. ASK y PZ analizaron la estructura de HERV-K. ASK, LL, JSR, JRP, AB y PZ escribieron el artículo con aportaciones de todos los autores.

Correspondence to Juan R. Perilla, Alberto Bartesaghi or Peijun Zhang.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Nature Communications agradece a Eric May, Wah Chiu y los demás revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Un archivo de revisión por pares está disponible.

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Reimpresiones y permisos

Krebs, AS., Liu, HF., Zhou, Y. et al. Arquitectura molecular y conservación de un retrovirus endógeno humano inmaduro. Nat Comuna 14, 5149 (2023). https://doi.org/10.1038/s41467-023-40786-w

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Recibido: 14 de enero de 2023

Aceptado: 09 de agosto de 2023

Publicado: 24 de agosto de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-023-40786-w

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