Base estructural del VIH

Nature Communications volumen 14, número de artículo: 1237 (2023) Citar este artículo

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Los inhibidores de la maduración (IM) del VIH-1, Bevirimat (BVM) y sus análogos interfieren con la escisión catalítica del péptido espaciador 1 (SP1) del dominio C-terminal de la proteína de la cápside (CACTD), al unirse y estabilizar la región CACTD-SP1. . Se están desarrollando MI como fármacos alternativos para complementar las terapias antirretrovirales actuales. Aunque prometedores, su mecanismo de acción y las vías de resistencia viral asociadas siguen siendo poco conocidos a nivel molecular, bioquímico y estructural. Informamos estructuras de RMN de giro de ángulo mágico de resolución atómica de ensamblajes microcristalinos de CACTD-SP1 formando complejos con BVM y/o el cofactor de ensamblaje hexakisfosfato de inositol (IP6). Nuestros resultados revelan un mecanismo por el cual BVM interrumpe la maduración, apretando el poro del haz de 6 hélices y apagando los movimientos de SP1 y el IP6 unido simultáneamente. Además, las variantes SP1-A1V y SP1-V7A resistentes a BVM exhiben características conformacionales y de unión distintas. En conjunto, nuestro estudio proporciona una explicación estructural de la resistencia de BVM, así como una guía para el diseño de nuevos MI.

La maduración del VIH-1 es desencadenada por la proteasa viral que escinde el precursor estructural de la poliproteína Gag en sus dominios constituyentes1,2,3. VIH-1 Gag alberga cinco sitios de escisión proteolítica entre sus cuatro dominios estructurales y funcionales principales y dos péptidos espaciadores: MA, CA, SP1, NC, SP2 y p6. El procesamiento avanza a diferentes velocidades, siendo el sitio SP1-NC el que se escinde más rápido y el sitio CA-SP1 el último4. Los estudios genéticos y enzimáticos demostraron que la inhibición de la escisión o incluso la desaceleración de la escisión en el sitio CA-SP1 es suficiente para interrumpir significativamente el proceso de maduración y anular la infectividad del virus. De hecho, los inhibidores de la maduración (IM) que interfieren con el procesamiento de CA-SP1 están surgiendo como candidatos atractivos para aumentar el arsenal actual de tratamientos para la infección por VIH5,6,7,8,9.

Los estudios bioquímicos y estructurales revelaron que la escisión lenta de CA-SP1 se debe al secuestro estructural del sitio de proteólisis10,11,12,13. Dentro de la red Gag inmadura del VIH-1 ensamblada, la unión CA-SP1 se pliega en una hélice α (la hélice de unión), que se autoasocia en un haz de 6 hélices, estabilizando el hexámero Gag13,14. El enlace escindible entre CA-L231 y SP1-A1 se encuentra en el medio de la hélice de unión y está ocluido dentro del haz de 6 hélices. Por lo tanto, para que la proteasa acceda a este sitio, el haz de 6 hélices debe desplegarse al menos parcialmente. Aunque no se ha determinado el mecanismo detallado de inhibición, los MI de molécula pequeña, como el ácido 3-O-(3',3'-dimetilsuccinil)-betulínico (Bevirimat o BVM), 1-[2-(4-terc- Se cree que butilfenil)-2-(2,3-dihidro-1H-inden-2-ilamino)etil]-3-(trifluorometil)piridin-2-ona (PF-46396) y sus análogos interfieren con la proteólisis al unirse a la unión CA-SP1 y estabilizando el haz de 6 hélices6,7,15,16,17,18. Por lo tanto, los MI no interfieren directamente con la unión del sustrato, sino que actúan indirectamente al inhibir el desarrollo del haz de 6 hélices y, de hecho, impiden el acceso de la proteasa a su sustrato.

A pesar de ser potentes inhibidores de la infección por VIH en entornos de laboratorio, los MI aún no han sido aprobados para uso clínico. BVM se sometió a ensayos clínicos de fase I y fase II, durante los cuales se observaron reducciones significativas de la carga viral dependientes de la dosis en individuos infectados por VIH-119. Sin embargo, estudios adicionales revelaron que hasta en el 50% de los pacientes, BVM no afectó las cargas virales20,21. Esta resistencia a BVM está asociada con polimorfos de secuencia viral que ocurren naturalmente, en particular cambios de aminoácidos de SP1 en los residuos 7 y 8 (SP1-V7A, -V7M, -T8Δ y -T8N)20. Además, se generaron variantes resistentes a BVM a través de múltiples rondas de selección contra BVM in vitro, lo que resultó en cambios de aminoácidos en los residuos 1 y 3 de SP1 (SP1-A1V, -A3T y -A3V); de estos, SP1-A1V no altera la replicación viral10.

El hexakisfosfato de inositol (IP6), una pequeña molécula cargada negativamente que abunda en las células, también estabiliza la unión CA-SP1 uniéndose al haz de 6 hélices. A diferencia de BVM, que se une en el centro del haz helicoidal14,18, IP6 se ​​encuentra justo encima del haz de 6 hélices y forma puentes salinos con dos anillos de cadenas laterales de lisina (CA-K158 y CA-K227)22. Aunque BVM también contiene carboxilatos cargados negativamente, no se ha establecido si estos pueden competir con IP6 en la interacción con los anillos de lisina.

Para evaluar cómo los MI se unen al sitio CA-SP1 y dilucidar los mecanismos que subyacen a la resistencia de BVM, determinamos estructuras de resolución atómica de RMN con giro de ángulo mágico (MAS) de complejos microcristalinos de un fragmento Gag de VIH-1 que abarca el dominio C-terminal de CA. (CACTD) y regiones SP1 (CACTD-SP1), en presencia de BVM y/o IP6. Las estructuras se calcularon basándose en una gran cantidad de restricciones de distancia, que se derivaron de correlaciones carbono-carbono y carbono-protón en espectros de alta calidad. Las correlaciones intermoleculares entre las resonancias de ligando y proteína nos permitieron verificar la unión simultánea de BVM e IP6, y asignar sin ambigüedades la orientación de unión de una molécula de BVM dentro del haz de 6 hélices de la unión CA-SP1. En general, las estructuras reportadas aquí proporcionan detalles a nivel atómico sin precedentes de cómo BVM e IP6 interactúan con CACTD-SP1, no disponibles en ninguna otra técnica estructural, y explican la base estructural de la inhibición de la maduración mediada por BVM y la resistencia de SP1-A1V y SP1-. Variantes V7A. Nuestro estudio también destaca el poder de la espectroscopia MAS NMR para observar directamente y caracterizar estructuralmente pequeñas moléculas unidas en grandes conjuntos macromoleculares con detalle a nivel atómico.

Las imágenes de microscopía electrónica de transmisión (TEM) con tinción negativa confirmaron hallazgos previos de que CACTD-SP1 formaba conjuntos microcristalinos en presencia de IP622 y que los conjuntos parecían similares en presencia o ausencia de BVM (Fig. 1a). Los experimentos de MAS NMR se realizaron utilizando once conjuntos de muestras, preparadas con diferentes combinaciones de marcadores isotópicos y en presencia o ausencia de BVM y/o IP6 (resumidos en la Tabla complementaria 1). Se registraron un total de catorce espectros unidimensionales (1D), setenta y uno bidimensionales (2D) y seis tridimensionales (3D). La sensibilidad y la resolución de los conjuntos de datos son excepcionalmente altas y permitieron asignaciones de resonancia troncales casi completas (96%). En general, se asignaron 8377 picos cruzados (Tabla 1; todas las asignaciones se resumen en la Figura 1 complementaria y en los Datos complementarios 1). Es importante destacar que los espectros de RMN MAS proporcionan firmas claras de cambio químico de 13C para redes maduras versus inmaduras (consulte la Figura complementaria 2). Todos los residuos de SP1 y cola de CACTD, excepto SP1-M14, dan lugar a picos distintos y bien resueltos en los espectros de RMN MAS (que se muestran en la Fig. 1b para un tramo de residuos de SP1 Q6 a I13). Es importante destacar que las resonancias de los residuos de cola C-terminal G144-S146 y de los residuos de cola SP1 T8-I13, que faltan en las estructuras de rayos X13, microED18 y crio-ET23, se detectaron y asignaron directamente en los experimentos de RMN MAS. La orientación de la cola C-terminal en la interfaz interhexamérica de la red cristalina CACTD-SP1 se define mediante la asignación inequívoca de las correlaciones G145-W184 encontradas en los espectros de RMN MAS (Fig. 1c). Los cambios químicos secundarios indican inequívocamente que los residuos 1-10 de SP1 son helicoidales en ausencia y presencia de BVM. Dicha conformación helicoidal es totalmente consistente con la estructura conocida de haz de 6 hélices de SP1 en la red Gag inmadura13,14,18,22, en contraste con la estructura en CA-SP1 ensamblado con alto contenido de sal sin IP6, donde los residuos de SP1 están desordenados dinámicamente. como se describió anteriormente24.

a Imágenes TEM con tinción negativa de microcristales CACTD-SP1 ensamblados con IP6, en presencia (izquierda) o ausencia de BVM (centro). Los recuadros muestran las transformadas de Fourier calculadas de las imágenes, indicando las redes hexagonales esperadas y los espacios entre celdas unitarias. Las barras de escala son de 100 nm. Secuencia de aminoácidos de CACTD-SP1 (derecha). b Tiras representativas de espectros MAS NMR 3D y 2D de matrices cristalinas de U-13C,15N-CACTD-SP1/BVM/SO4 (tiras blancas) y U-13C,15N-CACTD-SP1/IP6 (tiras grises), que ilustran asignaciones secuenciales para los residuos SP1 Q6-I13. Los espectros de MAS NMR están etiquetados de la siguiente manera: 3D NCACX (1), 3D NCOCX (2), 2D NCACX a −79 °C (3), 2D INADECUADO (4), 2D NCOCX a −79 °C (5), 2D CABLE (6), 2D NCACX (7). No se detectaron perturbaciones significativas del cambio químico para las muestras libres frente a las unidas a BVM o IP6 (consulte la Figura complementaria 3). c Panel superior: Superposición de regiones seleccionadas de espectros 2D CORD de matrices cristalinas U-13C, 15N-CACTD-SP1/BVM/IP6 para diferentes tiempos de mezcla: 100 ms (magenta) y 500 ms (gris). Panel central: superposición de regiones seleccionadas de espectros 2D NCACX (cian) y 2D PAIN-CP (gris) de matrices cristalinas U-13C,15N-CACTD-SP1/BVM/IP6. Las correlaciones inequívocas de largo alcance y entre residuos de los residuos de SP1 están marcadas por el número de aminoácidos en la secuencia. Panel inferior: se muestran las correlaciones entre hexámeros para las regiones seleccionadas de los espectros 2D CORD (izquierda) y CH HETCOR (centro) de U-13C, 15N-CACTD-SP1/BVM/IP6 y (H)NH HETCOR (derecha) espectros de U-13C, 15N, 2H-CACTD-SP1/IP6 (búfer B). d Número de restricciones de RMN MAS de largo alcance y todas entre residuos por residuo representadas frente al número de residuo. e Vista lateral del hexámero de hexámeros de matrices CACTD-SP1 unidas a BVM e IP6. f Expansión de las regiones entre hexámeros (panel superior) y entre cadenas (panel inferior) que muestran distancias obtenidas de experimentos de correlación de MAS NMR. g Estructura MAS NMR de un único hexámero de matriz cristalina CACTD-SP1 unida a BVM e IP6. Los residuos detectados por MAS NMR y no modelados en las estructuras de rayos X y crio-EM13, 14 se muestran en cian más oscuro.

Se detectó una gran cantidad de correlaciones intraproteínas en múltiples espectros de RMN MAS (Fig. 1c) y, dada la excelente resolución, no se necesitaron muestras diluidas isotópicamente con 13C para distinguir las correlaciones intramoleculares de las intermoleculares: todos los picos cruzados están bien resueltos y podrían asignarse de forma inequívoca, lo que permitirá extraer restricciones de distancia. En total, se obtuvieron 3048 restricciones de distancia proteína-proteína no redundantes e inequívocas (13C-13C, 15N-13C, 13C-1H y 15N-1H), que comprenden 674 de rango medio (1< |ij | <4), 627 de largo alcance (|ij | ≥5), con 39 restricciones entre cadenas de largo alcance y 22 restricciones entre hexámeros de largo alcance. Con casi 30 restricciones inequívocas no redundantes por residuo o más del 52% de integridad de restricción CC (ver Tabla 2) y una gran cantidad de restricciones entre residuos (1754) derivadas de correlaciones de largo alcance (Fig. 1d), hasta donde sabemos , este estudio arrojó el mayor número de restricciones de distancia de cualquier investigación de RMN MAS de proteínas hasta la fecha.

Detectamos correlaciones directas entre las moléculas pequeñas de abundancia natural, IP6 y BVM, y la proteína marcada isotópicamente. Para IP6, se observaron correlaciones entre CA-K158Cε e IP6-H2/H4/H6, lo que indica que CA-K158 media la unión de IP6. Se tradujeron en 6 restricciones, que involucraban dos cadenas adyacentes en el haz de 6 hélices para cada uno de los tres protones IP6. Además, se observó una correlación muy débil con CA-K227Cδ. Las correlaciones con BVM dieron como resultado 7 restricciones de distancia, que definieron sin ambigüedades la orientación de unión del inhibidor dentro del haz de 6 hélices. Estas correlaciones se resumen en la Fig. 2a. En la Tabla 2 se proporciona un resumen de todas las restricciones de distancia y en la Figura complementaria 4 se ilustra un gráfico de todos los contactos entre residuos.

a Superposición de regiones seleccionadas de espectros 2D HC CP HETCOR (tres paneles superiores) y espectros 2D dREDOR-HETCOR (panel inferior) de U-13C, 15N, 2H-CACTD-SP1/BVM/IP6 (gris) y U-13C, Conjuntos 15N,2H-CACTD-SP1/IP6 (cian). Los átomos BVM e IP6 1H y los residuos CACTD-SP1 con átomos 13C se indican fuera y dentro de cada espectro, respectivamente. b Identidad química de las moléculas IP6 y BVM. Los protones IP6 y BVM que interactúan con los residuos de CACTD-SP1 se muestran en cian y gris, respectivamente. c Panel superior: modo de enlace IP6 en el hexámero de los ensamblajes CACTD-SP1/IP6 (cian oscuro, PDB: 7R7Q, este trabajo). Panel inferior: modos de enlace IP6 y BVM en el hexámero de los ensamblajes CACTD-SP1/BVM/IP6 (gris, PDB: 7R7P, este trabajo). Los residuos que interactúan con IP6 o BVM se muestran como barras. d Superposición de la estructura MAS NMR de CACTD-SP1/BVM/IP6 y CACTD-SP1/IP6 mostrada en vista lateral (arriba) y vista superior (abajo). La unión de BVM induce importantes reordenamientos estructurales de las hélices SP1, lo que resulta en el endurecimiento del poro y la extinción de los movimientos del IP6 unido simultáneamente. Los residuos coloreados en magenta dan lugar a picos de alta intensidad, correspondientes a correlaciones intra e interresiduos tras la unión de BVM.

La estructura de una sola cadena de CACTD-SP1 se calculó utilizando únicamente restricciones de distancia experimentales de MAS NMR y restricciones diédricas. Esta estructura se utilizó para calcular estructuras de proteínas de orden superior en complejo con BVM e IP6 (los detalles del cálculo de la estructura se proporcionan en la sección Materiales y métodos). Las estructuras de orden superior (Fig. 1e) se calcularon integrando las restricciones experimentales de MAS NMR (es decir, restricciones de distancia proteína-proteína, proteína-BVM y proteína-IP6 y ángulo de torsión de proteína) y una envoltura estructural de hexámero de hexámeros generada. a partir de coordenadas de rayos X del hexámero CACTD-SP1 (PDB: 5I4T)13. La unidad de hexámero de hexámeros representa el bloque de construcción mínimo que recapitula las interfaces críticas entre hexámeros en la red de la cápside inmadura. Los contactos entre cadenas y entre hexámeros CACTD-SP1 derivados de MAS NMR se muestran en la Fig. 1f.

Como se describió anteriormente13,14,18,22, el hexámero CACTD-SP1 exhibe la forma de una copa, con el dominio CACTD globular formando la copa y la unión CA-SP1 del haz de 6 hélices formando el vástago. En la estructura cristalina de CACTD-SP1 y la estructura crio-EM de Gag de longitud completa, la hélice de unión termina alrededor del residuo SP1-V7, y los residuos restantes no son visibles, probablemente debido a un trastorno conformacional13,18,22. Sorprendentemente, toda la región SP1, incluida la cola SP1, excepto SP1-M14, está bien definida en las estructuras de MAS NMR (Fig. 1g y Fig. Suplementarias 5 y 6). Los cambios químicos de MAS NMR predicen una conformación helicoidal hasta SP1-T10, con los últimos 4 residuos (A11-M14) en una estructura de espiral aleatoria (Fig. 1g). Para los residuos SP1-E2, S5, T8, N9, T10, T12 e I13, las intensidades máximas son bajas, lo que sugiere heterogeneidad conformacional (Fig. 1b), de acuerdo con los datos de rayos X13 y crio-EM14.

En la estructura unida a BVM, el inhibidor se ubica dentro del canal formado por el haz de 6 hélices, con el anillo de esterol ocupando el interior hidrofóbico del canal y haciendo contacto con los residuos proteicos CA-H226, K227, L231 y SP1-. M4. El resto dimetilsuccinilo está orientado hacia la copa CACTD, como lo indican inequívocamente las correlaciones H32(BVM)-P224Cβ(proteína) y H3(BVM)-K227Cβ(proteína), mientras que el grupo vinilo apunta hacia la cola SP1, como lo sugiere H19. Correlaciones (BVM) -L231Cβ (proteína) y H29 (BVM) -L231Cβ (proteína) (Fig. 2a, b). Por lo tanto, se observa experimentalmente una única orientación BVM hacia arriba, contrariamente a las conclusiones de un estudio computacional reciente, donde se consideraron posibles ambas orientaciones BVM hacia arriba y BVM hacia abajo.25 Además, L231 y SP1-M4 interactúan asimétricamente con el El grupo de vinilo BVM, es decir, 3 de cada 6 cadenas del haz de 6 hélices exhiben contactos directos con BVM. Esta información sobre las interacciones asimétricas de BVM con las cadenas laterales de proteínas no está disponible en ninguna de las estructuras anteriores.18,25,26 Curiosamente, un estudio computacional reciente sugirió que BVM gira dentro del poro del hexámero CACTD-SP1 en la escala de tiempo de la MD. simulación y contacta diferentes protómeros durante este proceso.25 También se sugirió que BVM interactúa uniformemente con L231 a lo largo de las seis hélices, mientras que se observan interacciones preferenciales con algunos residuos SP1-M4. Nuestros resultados experimentales indican que BVM no sufre movimientos dentro del haz de seis hélices en escalas de tiempo de nano a microsegundos lentos y la asimetría de la unión de BVM a la proteína observada para todos los residuos que interactúan, incluidos L231 y SP1-M4, tiene un carácter estático. En resumen, nuestra estructura confirma que BVM organiza la unión CA-SP1 uniéndose dentro del canal central del haz de 6 hélices14,18, rompe la simetría con respecto a las cadenas laterales y, lo que es más importante, define la orientación del fármaco unido.

La comparación de las estructuras en presencia y ausencia de BVM muestra claramente que la unión de BVM da como resultado un aparente endurecimiento del poro del hexámero (Fig. 2c, d) a través de un reordenamiento estructural en las hélices de unión CA-SP1 y giro β tipo II. Este mecanismo de cierre de poros descubierto aquí no se informó en un estudio previo de microDE18 (Figura complementaria 7). Curiosamente, en una investigación de RMN de estado sólido previamente informada sobre la unión de BVM a partículas similares a virus (VLP), se discutió la posibilidad de desestabilización del segmento que precede a la hélice de unión debido a la unión de BVM, aunque no está respaldada directamente por datos experimentales27. Esos resultados son consistentes con nuestra observación del estrechamiento de los poros y la diferencia en la posición del giro β tipo II (G220-P224) en presencia de BVM (Fig. 2d). También observamos una heterogeneidad conformacional pronunciada de CA-P157, K158, E159 y SP1-M4, lo que indica asimetría de las seis copias de la cadena lateral de la proteína en el anillo hexamérica. Este resultado proporciona evidencia adicional de que una única molécula de BVM asimétrica está unida dentro del haz de 6 hélices (Figura complementaria 8). Además, la cola de SP1 se vuelve menos dinámica tras la unión de BVM, como es evidente en el aumento de las intensidades de los picos cruzados de los residuos de la cola, junto con una reorientación concomitante de las cadenas laterales de los residuos cercanos al sitio de unión, como CA-P157, K158, E159, N195, G220, V221, G222, G223, P224, K227, V230, L231 y SP1-E2 (Figs. 2d y 3a, paneles superiores y Fig. complementaria 9). Sugerimos que todos estos cambios estructurales contribuyen al efecto estabilizador de la unión de BVM.

a Superposición de regiones seleccionadas de espectros 2D HC CP HETCOR de U-13C,15N,2H-CACTD-SP1/BVM/IP6 (gris) y U-13C,15N,2H-CACTD-SP1/IP6 (cian) (panel superior ); U-13C,15N,2H-CACTD-SP1-V7A/BVM/IP6 (magenta) y U-13C,15N,2H-CACTD-SP1-V7A/IP6 (verde claro) (panel central); y U-13C,15N,2H-CACTD-SP1-A1V/BVM/IP6 (naranja) y U-13C,15N,2H-CACTD-SP1-A1V/IP6 (púrpura) (panel inferior). Se marcan las correlaciones intra e interresiduos que surgen de la unión de BVM solo en WT CACTD-SP1 pero no en CACTD-SP1-V7A o CACTD-SP1-A1V. Los residuos que muestran múltiples conformadores se indican con a, b, c. b Superposición de regiones seleccionadas de espectros CORD 2D de U-13C,15N,2H-CACTD-SP1/BVM/IP6 (gris) y U-13C,15N,2H-CACTD-SP1/IP6 (cian) (panel superior); U-13C,15N,2H-CACTD-SP1-V7A/BVM/IP6 (magenta) y U-13C,15N,2H-CACTD-SP1-V7A/IP6 (verde claro) (panel central); y U-13C,15N,2H-CACTD-SP1-A1V/BVM/IP6 (naranja) y U-13C,15N,2H-CACTD-SP1-A1V/IP6 (púrpura) (panel inferior). Se marcan los picos cruzados dentro del residuo que muestran cambios de intensidad o cambios químicos debido a la unión de BVM en WT CACTD-SP1. Las correlaciones correspondientes están ausentes o exhiben pequeñas perturbaciones de desplazamiento químico tras la unión de BVM a CACTD-SP1-V7A/BVM/IP6 y en CACTD-SP1-A1V/BVM/IP6. c Superior y medio: espectros de polarización directa 31P (DP, superior) y polarización cruzada (CP, medio) de U-13C,15N,2H-CACTD-SP1/BVM/IP6 (gris), U-13C,15N,2H- CACTD-SP1/IP6 (cian), U-13C,15N,2H-CACTD-SP1-V7A/BVM/IP6 (magenta), U-13C,15N,2H-CACTD-SP1-V7A/IP6 (verde claro), U-13C,15N,2H-CACTD-SP1-A1V/BVM/IP6 (naranja) y U-13C,15N,2H-CACTD-SP1-A1V/IP6 (púrpura). Abajo: Superposición de espectros 2D (H)PH HETCOR de U-13C,15N,2H-CACTD-SP1/BVM/IP6 (gris) y U-13C,15N,2H-CACTD-SP1-V7A/BVM/IP6 (magenta ) (izquierda). Orientación inclinada de IP6 en WT CACTD-SP1/BVM/IP6 (centro) (PDB: 7R7P, este trabajo). Orientación horizontal de IP6 en CACTD-SP1-V7A/BVM/IP6 (derecha). d Perturbaciones del cambio químico inducidas por la unión de BVM en WT CACTD-SP1 (arriba), CACTD-SP1-V7A (centro) y CACTD-SP1-A1V (abajo), representadas frente al número de residuos. e Estructura CACTD-SP1/BVM/IP6 con residuos que exhiben CSP únicos, correlaciones intra e interresiduos e intensidades de pico mejoradas tras la unión de BVM a WT CACTD-SP1 que se muestra en azul.

Es importante destacar que nuestros datos revelaron que BVM e IP6 pueden unirse al hexámero CACTD-SP1 simultáneamente, como se propuso recientemente25,26,28. Esto está respaldado por la observación de distintos conjuntos de correlaciones entre IP6 y CACTD-SP1 en presencia y ausencia de BVM. Es importante destacar que el modo de interacción entre IP6 y CACTD-SP1 es distinto en presencia y ausencia de BVM. Específicamente, los conjuntos de datos 1H-13C HETCOR y dREDOR-HETCOR revelan correlaciones entre múltiples protones de BVM (H3, H16, H19, H23, H24, H29, H32) e IP6 (H2, H4, H6) con diferentes residuos de CACTD-SP1. (Fig. 2a), lo que implica que la unión de IP6 y BVM no es competitiva. En ausencia de BVM, IP6 se ​​une casi horizontalmente dentro de la región del cuello del canal dentro del haz de 6 hélices, coordinado por seis residuos CA-K158 y seis CA-K227. Esta configuración está respaldada por correlaciones entre el grupo de resonancias IP6 H2 / H4 / H6 (los cambios químicos son demasiado cercanos para asignarlos a átomos individuales) y los átomos de Cε de seis cadenas laterales CA-K158 (Fig. 2a). Se observa una débil correlación H2/H4/H6(IP6) con CA-K227Cδ, lo que confirma un contacto específico entre IP6 y este residuo, de acuerdo con informes recientes22. Curiosamente, no se observan correlaciones equivalentes en los espectros 1H-31P 1D CPMAS o 2D HETCOR (Fig. 3c), lo que indica que la coordinación por los doce residuos de lisina se promedia dinámicamente, con IP6 experimentando movimientos locales dentro del poro. Por el contrario, cuando se une BVM, aparecen tres picos cruzados intensos en el espectro 2D (H)PH HETCOR de U-13C, 15N, 2H-CACTD-SP1/BVM/IP6 (Fig. 3c), correspondientes a correlaciones entre 3 diferentes átomos de fósforo de IP6 y las cadenas laterales de los residuos CA-K158, K227 y P224. La presencia de picos cruzados intensos implica que se detiene el movimiento de IP6 en presencia de BVM. Actualmente no está claro si la detención del movimiento de IP6 está relacionada con la estabilización del haz de 6 hélices, aunque la dinámica de IP6 ligada se puede utilizar para evaluar la actividad del IM (ver más abajo).

Comprender los mecanismos de resistencia a los inhibidores de MI es de vital importancia para un mayor desarrollo de moléculas como los fármacos. Por lo tanto, evaluamos cómo las variantes de CACTD-SP1 asociadas con la resistencia a BVM afectan la unión. Se prepararon conjuntos CACTD-SP1 que albergaban las sustituciones SP1-A1V y V7A y se registraron espectros 2D 1H-13C HETCOR, 13C-13C CORD, 1D 31P DP y CPMAS, y 2D (H)PH HETCOR en presencia y ausencia de BVM y /o IP6 (Fig. 3a-c). En ausencia de BVM, las intensidades máximas para la mayoría de los residuos SP1 en las variantes A1V y V7A son considerablemente más bajas que para la proteína de tipo salvaje (WT), y faltan muchas correlaciones asociadas con otras regiones (Figura 10 complementaria). Este resultado indica que, en ambas variantes, las regiones SP1 son inherentemente más dinámicas que en la proteína WT. La comparación de las perturbaciones de desplazamiento químico (CSP) de 13C inducidas por BVM para el WT y las dos variantes, A1V y V7A, reveló los CSP más extensos para los conjuntos WT, especialmente para las resonancias asociadas con los residuos en SP1 (M4, S5, T8, T10, A11), el giro β tipo II (CA-G223, G225) y la hélice de unión (CA-H226) (Fig. 3d, e). Para la variante A1V, no encontramos ninguna de las correlaciones proteína-BVM que se observaron con WT CACTD-SP1, lo que indica que BVM se une muy débilmente, es muy móvil o no se une en absoluto (Figura complementaria 11). Por el contrario, observamos CSP modestos, pero estadísticamente significativos con V7A, lo que indica que esta variante se une a BVM de manera más eficiente que A1V (pero menos eficientemente que WT). Curiosamente, la unión de BVM a los conjuntos V7A no hizo que el complejo fuera más rígido, en contraste con las observaciones para WT CACTD-SP1, ya que ninguna de las correlaciones equivalentes está presente en los espectros de MAS NMR (Fig. 3a, b). De acuerdo con los datos de CSP, se observaron señales 31P de IP6 en espectros CPMAS 1D 31P de conjuntos CACTD-SP1-V7A/BVM/IP6 (Fig. 3c), similares a los hallazgos para WT CACTD-SP1/BVM/IP6, mientras que están ausentes en las muestras CACTD-SP1-A1V/BVM/IP6. Por lo tanto, concluimos que IP6 tiene movimiento restringido en presencia de BVM en ensamblajes CACTD-SP1-V7A, pero móvil en ensamblajes de CACTD-SP1-A1V. Además, la dinámica de IP6 en CACTD-SP1-A1V sugiere fuertemente la pérdida de unión a BVM en lugar de una unión débil. Nuestros datos se correlacionan bien con observaciones de estudios de virología29,30, que revelan que las partículas similares a virus (VLP) que albergan la mutación SP1-A1V se unen a BVM de manera menos eficiente que WT 30. En un estudio previo de dinámica molecular25, la pérdida de simetría de los 6 También se observó haz de hélice. Además, el procesamiento de CA-SP1 es más rápido en los viriones mutantes SP1-A1V, en comparación con el virus WT, lo que coincide con la noción de que la variante SP1-A1V posee un haz de 6 hélices conformacionalmente más dinámico10,25. Por el contrario, el procesamiento de CA-SP1 en los viriones SP1-V7A y WT es similar21, lo que sugiere diferentes mecanismos de resistencia a BVM para las variantes de secuencia SP1-V7A y SP1-A1V29. En conjunto, nuestros resultados de MAS NMR sugieren que distintos mecanismos pueden asociarse con la pérdida de unión de BVM a variantes resistentes a MI.

Los espectros 2D (H) PH HETCOR de los conjuntos WT CACTD-SP1/BVM/IP6 y CACTD-SP1-V7A/BVM/IP6 revelan distintos picos cruzados de 31P (IP6) -1H (proteína) (Fig. 3c). Para la proteína WT, están presentes tres correlaciones: P4/6(IP6)-K158Hε2 (proteína), P5(IP6)-K227Hε2 (proteína) y P4/6(IP6)-P224Hδ2 (proteína). Para CACTD-SP1-V7A, se observan correlaciones P1/3/4/6(IP6)-P157Hδ2(proteína), P2(IP6)-K158Hα(proteína) y P4/6(IP6)-P160Hα(proteína) (Fig. .3c y Fig. complementaria 12 y 13). Por el contrario, no se observan correlaciones en los espectros CACTD-SP1-A1V, lo que sugiere que IP6 es dinámico. Para WT CACTD-SP1, la correlación entre un solo átomo de fósforo (P5) de IP6 y SP1-K227Hε2 sugiere que IP6 se ​​enfrenta solo a uno de los seis residuos de CA-K227. El hecho de que no se observen correlaciones con P2 y P1, 3 en los espectros WT CACTD-SP1 es consistente con una orientación inclinada de IP6 (Fig. 3c). Para la variante SP1-V7A, la ausencia de correlaciones de IP6 con CA-K227, junto con la presencia de correlaciones de IP6 con CA-P157, K158 y P160, sugiere que IP6 adopta una orientación horizontal en la región del cuello (Fig. 3c). . Postulamos que las distintas propiedades dinámicas y orientaciones adoptadas por IP6 en los conjuntos de proteínas WT, SP1-A1V y SP1-V7A pueden correlacionarse con la actividad inhibidora de BVM contra los virus resistentes, lo que sugiere la tentadora posibilidad de que 31P MAS NMR de los conjuntos unidos a IP6 podría desarrollarse para la detección de IM.

Aquí, presentamos estructuras MAS-NMR de la red CACTD-SP1 en complejo con IP6, en presencia o ausencia de BVM, que revelan detalles a nivel atómico de las interacciones proteína-ligando. En particular, nuestros datos confirman que BVM se une dentro del poro del haz de 6 hélices CACTD-SP1, simultáneamente con IP6. Es importante destacar que definimos sin ambigüedades la orientación de unión de ambos ligandos y demostramos que BVM provoca el estrechamiento de los poros asociado con reordenamientos estructurales de los residuos en las hélices SP1 y apaga la dinámica del IP6 unido simultáneamente, lo que es consistente con la estabilización del haz de 6 hélices14,15. 16,18,25,31. Además, descubrimos efectos previamente desconocidos de BVM para detener la dinámica de IP6 y atenuar los movimientos de la cadena lateral de los residuos de CACTD-SP1 que interactúan con IP6, lo que colectivamente podría contribuir a prevenir el acceso de la proteasa al sitio de escisión de CA-SP1. Además, descubrimos que la resistencia a BVM en las variantes SP1-A1V y SP1-V7A se asocia con la pérdida de unión a MI o la pérdida de una conformación estable del haz de 6 hélices, respectivamente.

Además de proporcionar importantes conocimientos moleculares sobre los efectos mediados por BVM para la maduración de Gag, nuestro estudio también representa un importante avance tecnológico en MAS NMR, más allá de los enfoques comúnmente utilizados para la caracterización de ligandos unidos que requieren su marcaje isotópico con 13C. Esto fue posible mediante la explotación juiciosa de las resonancias 1H de BVM, así como de las resonancias 1H y 31P de IP6. Además, la deuteración de los experimentos filtrados con CACTD-SP1 y dREDOR resultó fundamental para este fin. Finalmente, la dilución isotópica de 13C no fue necesaria para las estructuras actuales de MAS NMR de ensamblajes de orden superior.

En conjunto, los hallazgos presentados aquí no solo aclaran los detalles atómicos de la unión de BVM al CACTD-SP1 del VIH-1 e informan sobre los mecanismos de resistencia a BVM, sino que también pueden sugerir nuevas estrategias para el diseño de MI de próxima generación más potentes.

El plásmido de expresión para el fragmento CACTD-SP1 de la cepa NL4-3 Gag del VIH-1 que contiene una etiqueta His no escindible y la mutación P373T (SP1-P10T) se describió previamente13. Las mutaciones SP1-V7A y A1V se introdujeron en la construcción mediante mutagénesis Quikchange (Agilent). El polimorfo de secuencia SP1-T10 exhibe los mismos perfiles de infectividad y actividad antiviral BVM (IC50) que SP1-P10, como se muestra en la Fig. 14 complementaria. Las proteínas se expresaron en células E. coli BL21 (DE3) transformadas, que se cultivaron en una incubadora con agitador a 37 °C hasta la fase logarítmica media (OD600 de 0,6-1) y luego se indujo con IPTG 1 mM durante la noche a 18 °C. La expresión de las proteínas CACTD-SP1 enriquecidas con U-13C, 15N y enriquecidas con U-13C, 15N, 2H tuvo pasos de precultivo adicionales para adaptar lentamente las células del medio rico al medio mínimo, y se realizó como se informó anteriormente 32,33. Las células se recogieron mediante centrifugación y se almacenaron a -80 °C hasta su uso.

La purificación de proteínas se realizó como se describió anteriormente13. En resumen, los sedimentos bacterianos se resuspendieron en Tris 50 mM, pH 8,3, LiCl 1 M, que contenían tabletas de inhibidor de proteasa (Roche) y se complementaron con desoxicolato al 0,3% (p/v). Las células se lisaron mediante incubación con lisozima, seguido de sonicación. Los lisados ​​se clarificaron mediante centrifugación, se filtraron y se incubaron con resina de agarosa Ni-NTA (Qiagen) durante 30 minutos a 4 °C. Las fracciones no unidas se eliminaron por lavado y la proteína unida se eluyó mediante un gradiente escalonado de imidazol 15 mM a imidazol 300 mM. La proteína se purificó hasta homogeneidad usando cromatografía de intercambio aniónico en Tris 20 mM, pH 8,0, NaCl 0,5 M. La proteína pura se concentró a 10 mg/ml, se congeló instantáneamente en nitrógeno líquido y se almacenó a -80 °C hasta su uso.

Se prepararon dos conjuntos de muestras de U-13C,15N,2H-CACTD-SP1/IP6, uno en tampón A (Tris 20 mM, pD 8,0, NaCl 0,5 M; elaborado a partir de una solución madre de Tris 1 M con una pureza del 99,9 % en D2O (Cambridge ) y pD ajustado con cloruro de deuterio (Sigma) preparado en D2O con una pureza del 99,9% (Cambridge)) y el segundo en Tampón B (Tris 20 mM, pH 8,0, NaCl 0,5 M). Las muestras de proteína en Tampón A se prepararon mediante intercambio de tampón de la siguiente manera: se diluyeron 0,5 ml de proteína a 10 mg/ml en 10 ml con Tampón A y luego se volvieron a concentrar mediante centrifugación, 4 veces. Después del intercambio, las muestras se recuperaron en un volumen final de 0,5 ml, con concentraciones entre 9 y 10 mg/ml.

Las proteínas se ensamblaron con IP6 1,6 mM (Sigma-Aldrich) y BVM 1,4 mM (Sigma-Aldrich), en un volumen de reacción final de 1 ml. Algunas muestras que se utilizaron para obtener o confirmar asignaciones de resonancia se ensamblaron mezclando proteína con un volumen igual de sulfato de amonio 1,5 M (Sigma-Aldrich), Tris 0,1 M, pH 8,5. Los conjuntos se incubaron durante la noche. Se obtuvieron ensamblajes óptimos a temperaturas de incubación de 16-20 °C. Los conjuntos marcados con U-13C, 15N (~ 50 mg de proteína) se centrifugaron a 10000 x g y se empaquetaron en rotores Bruker de paredes delgadas de 3,2 mm. Los conjuntos de proteínas intercambiadas con tampón (~17 mg de proteína) se centrifugaron a 10000 x g y se empaquetaron en rotores Bruker de 1,9 mm.

La actividad de BVM contra SP1-P10 y el derivado de SP1-T10 se determinó esencialmente como se informó anteriormente29. Brevemente, se transfectaron células T HEK 293 (ATCC, Cat# CRL-3216) con clones moleculares pNL4-3/SP1-P10 o pNL4-3/SP1-T10, y las células transfectadas se trataron con 24 concentraciones de BVM que oscilaban entre 0 a 10 µM. Se recogieron los sobrenadantes que contenían virus, se normalizaron para determinar la actividad de la transcriptasa inversa (RT) y se usaron para infectar la línea celular indicadora TZM-bl. Los datos de infectividad se analizaron con GraphPad Prism 7 a partir de tres experimentos independientes. Las curvas se ajustaron mediante regresión no lineal como log(inhibidor) frente a respuesta normalizada, con una pendiente variable mediante un ajuste de mínimos cuadrados (ordinario).

Para medir la infectividad relativa de SP1-P10 frente al derivado de SP1-T10, se transfectaron células T HEK 293 con los clones moleculares pNL4-3/SP1-P10 o pNL4-3/SP1-T10. Se recogieron los sobrenadantes que contenían virus, se normalizaron para determinar la actividad RT y se usaron para infectar la línea celular indicadora TZM-bl. La actividad luciferasa se midió 2 días después de la infección. Las infectividades específicas se presentan en relación con las del SP1-P10 (100%). Las barras de error indican desviaciones estándar (n = 4 ensayos independientes realizados por duplicado) (Figura complementaria 14).

Experimentos de RMN MAS en U-13C,15N-CACTD-SP1/BVM/IP6, U-13C,15N-CACTD-SP1/IP6, U-13C,15N-CACTD-SP1/BVM/SO4, U-13C,15N- Las matrices cristalinas CACTD-SP1/SO4 se realizaron en un espectrómetro Bruker AVIII de 20,0 T equipado con una sonda de HCN libre de E de 3,2 mm. La frecuencia MAS se controló a 14 kHz dentro de ±10 Hz mediante un controlador Bruker MAS. La temperatura real de la muestra se mantuvo a 4 ± 1 °C durante todos los experimentos y a −10 ± 1 °C para algunos experimentos específicos utilizando el controlador de temperatura Bruker. Las frecuencias de Larmor fueron 850,4 MHz (1H), 213,9 MHz (13C) y 86,2 MHz (15N) a 20,0 T. Las longitudes típicas de pulso de 90° fueron 2,6-3,0 μs para 1H y 4,3-4,5 μs para 13C, y 4,2- 4,7 µs para 15N. La polarización cruzada de 1H-13C y 1H-15N empleó una rampa de amplitud lineal de 90-110% en 1H, y el centro de la rampa coincidió con las condiciones de Hartmann-Hahn en la primera banda lateral giratoria, con tiempos de contacto de 0,7-1,5 ms. y 1,0-1,7 ms, respectivamente. Se aplicaron diferentes tiempos de mezcla 2D combinados impulsados ​​por R2nν (CORD) 34, como 10 ms, 50 ms, 100 ms, para diferentes experimentos y la intensidad del campo 1H durante CORD fue de 14 kHz. La transferencia de magnetización selectiva de banda del tiempo de contacto de 15N a 13C fue de 6,0 a 6,5 ​​ms. Se utilizó el desacoplamiento SPINAL-6435 (83-95 kHz) durante los períodos de evolución y adquisición.

Los experimentos de MAS NMR también se realizaron en un espectrómetro Magnex/Bruker AVIII de 14,1 T equipado con una sonda de HCN libre de E de 3,2 mm. Las frecuencias de Larmor fueron 599,8 MHz (1H), 150,8 MHz (13C) y 60,7 MHz (15N) a 14,1 T. Las longitudes típicas de pulso de 90° fueron 2,6-3,0 μs para 1H y 4,0-4,7 μs para 13C, y 4,2- 4,6 µs para 15N. La polarización cruzada de 1H-13C y 1H-15N empleó una rampa de amplitud lineal de 90-110% en 1H, y el centro de la rampa coincidió con las condiciones de Hartmann-Hahn en la primera banda lateral giratoria, con tiempos de contacto de 1,1-2,0 ms. y 1,3-1,8 ms, respectivamente. Se aplicaron diferentes tiempos de mezcla de CORD, como 25 ms, 100 ms, 250 ms, 500 ms, para diferentes experimentos y la intensidad del campo 1H durante CORD fue de 14 kHz. El tiempo de contacto de banda selectiva 15N-13C SPECIFIC-CP fue de 4,0 a 6,0 ms. Se utilizó el desacoplamiento SPINAL-6435 (80-86 kHz) durante los períodos de evolución y adquisición. También se adquirió el experimento de polarización cruzada de núcleos insensibles asistidos por protones detectados por 13C con desplazamiento de fase 2D (PAIN-CP) 33 para la matriz cristalina U-13C, 15N-CACTD-SP1/BVM/IP6. Durante el período de mezcla de PAIN-CP, las intensidades de campo para los canales 1H, 15N y 13C fueron todas de 60 kHz. La duración del período de mezcla de PAIN-CP fue de 4 ms.

Los experimentos de RMN MAS a baja temperatura de U-13C, 15N-CACTD-SP1/IP6 se ​​realizaron en un espectrómetro Bruker AVIII de 17,6 T equipado con una sonda de HCN libre de E de baja T de 3,2 mm. La frecuencia MAS se controló a 15 kHz dentro de ±10 Hz mediante un controlador Bruker MAS. La temperatura real de la muestra se mantuvo a −37 ± 1 °C y −79 ± 1 °C para los experimentos correspondientes. Las frecuencias de Larmor fueron 750,1 MHz (1H), 188,6 MHz (13C) y 76,0 MHz (15N) a 17,6 T. Las longitudes de pulso típicas de 90° fueron 2,5 μs para 1H, 3,1 μs para 13C y 3,3 μs para 15N. La polarización cruzada de 1H-13C y 1H-15N empleó una rampa de amplitud lineal del 70-100 % en 1H, y el centro de la rampa coincidió con las condiciones de Hartmann-Hahn en la primera banda lateral giratoria, con tiempos de contacto de 0,6 ms y 0,9 ms. ms, respectivamente. Se aplicó un tiempo de mezcla CORD de 25 ms para diferentes experimentos y la intensidad del campo 1H durante CORD fue de 15 kHz. La transferencia de magnetización selectiva de banda del tiempo de contacto de 15N a 13C fue de 5,0 a 6,0 ms. Se utilizó el desacoplamiento SWFTPPM (80 kHz) durante los períodos de evolución y adquisición.

Los experimentos de MAS NMR de matrices cristalinas U-13C,15N,2H-CACTD-SP1/BVM/IP6, U-13C,15N,2H-CACTD-SP1/IP6 se ​​realizaron en un espectrómetro Bruker AVIII de 20,0 T equipado con una sonda de HCN de 1,9 mm. . Las longitudes típicas de pulso de 90° fueron de 3,0 a 3,1 μs para 1H, de 3,9 a 4,0 μs para 13C y de 3,9 a 4,0 μs para 15N. La polarización cruzada de 1H-13C y 1H-15N empleó una rampa de amplitud lineal de 90-110% en 1H, con el centro de la rampa adaptado a las condiciones de Hartmann-Hahn en la primera banda lateral giratoria; Los tiempos de contacto fueron de 0,3 a 2,6 ms y de 1,4 a 1,8 ms, respectivamente. La frecuencia MAS fue de 40 kHz, controlada dentro de ±10 Hz mediante un controlador Bruker MAS. La temperatura real de la muestra se mantuvo a 4 ± 1 °C durante todos los experimentos utilizando el controlador de temperatura Bruker. Los experimentos con filtrado REDOR doble de MAS NMR emplearon períodos de desfase simultáneos de 1H13C/1H15N REDOR de 5 ms, para eliminar señales de 1H directamente unidos a 13C y 15N. La polarización cruzada de 1H-13C empleó una rampa de amplitud lineal de 90-110% en 1H, y el centro de la rampa coincidió con las condiciones de Hartmann-Hahn en la primera banda lateral giratoria, con tiempos de contacto de 10 ms.

Experimentos de RMN MAS de U-13C,15N,2H-CACTD-SP1/BVM/IP6, U-13C,15N,2H-CACTD-SP1/IP6, U-13C,15N,2H-CACTD-SP1-V7A/BVM/ IP6, U-13C,15N,2H-CACTD-SP1-V7A/IP6, U-13C,15N,2H-CACTD-SP1-A1V/BVM/IP6, U-13C,15N,2H-CACTD-SP1-A1V/ Las matrices cristalinas IP6 se ​​realizaron en un espectrómetro Bruker AVIII de 20,0 T equipado con una sonda HX de 1,9 mm. Las longitudes típicas de pulso de 90° fueron de 2,3 a 3,1 μs para 1H y de 3,0 a 3,3 μs para 13C. La polarización cruzada de 1H-13C empleó una rampa de amplitud lineal de 90-110% en 1H, con el centro de la rampa adaptado a las condiciones de Hartmann-Hahn en la primera banda lateral giratoria; El tiempo de contacto fue de 2 ms. La frecuencia MAS fue de 40 kHz y 14 kHz, controlada dentro de ±10 Hz mediante un controlador Bruker MAS. La temperatura real de la muestra se mantuvo a 4 ± 1 °C y a –5 ± 1 °C para algunos experimentos específicos utilizando el controlador de temperatura Bruker.

Los espectros de RMN MAS en estado sólido de 31P se adquirieron en un espectrómetro Bruker AVIII de 20,0 T equipado con una sonda HX de 1,9 mm. Las longitudes típicas de pulso de 90° fueron 2,3 μs para 1H y 3,0 μs para 31P. La polarización cruzada 1H-31P empleó una rampa de amplitud lineal de 90-110% en 1H, y el centro de la rampa coincidió con las condiciones de Hartmann-Hahn en la primera banda lateral giratoria, con tiempos de contacto de 3,5 ms y 2,5 ms para salida y transferencias de CP hacia atrás, respectivamente. La frecuencia MAS fue de 40 kHz, controlada dentro de ±10 Hz mediante un controlador Bruker MAS. La temperatura real de la muestra se mantuvo a 4 ± 1 °C durante todos los experimentos utilizando el controlador de temperatura Bruker.

Los espectros de RMN en solución 1D 1H y 13C de BVM/DMSO-D6 e IP6/D2O se recogieron en un espectrómetro Bruker Avance de 14,1 T (frecuencia Larmor 1H de 600,1 MHz) utilizando una sonda de detección inversa (TXI) de triple resonancia. Los espectros de RMN 1H de BVM e IP6 se ​​muestran en las figuras complementarias 12 y 15.

Todos los datos de MAS NMR se procesaron utilizando Bruker TopSpin y NMRpipe36. Las señales de 13C y 15N fueron referenciadas con respecto a los estándares externos adamantano y cloruro de amonio, respectivamente. 1H se refirió al pico de agua a 4,7 ppm. Se hizo referencia al 31P con respecto a la resonancia de fósforo del 85% de H3PO4. Los conjuntos de datos 2D y 3D se procesaron aplicando una apodización de campana sinusoidal desplazada de 30°, 45°, 60° y 90° seguida de una transformación de Lorentziano a Gaussiano en ambas dimensiones. En algunos conjuntos de datos se utilizó predicción lineal directa al doble del número de puntos de datos originales en la dimensión indirecta, seguida de un llenado cero. Los datos 2D CH HETCOR y dREDOR-HETCOR de muestras U-13C, 15N, 2H-CACTD-SP1 se procesaron con apodización gaussiana y corrección de línea base en cuadratura.

Todos los espectros se analizaron utilizando CCPN37 y NMRFAM-Sparky38,39. La superposición de los espectros U-13C,15N-CACTD-SP1/BVM/IP6, U-13C,15N-CACTD-SP1/IP6 y U-13C,15N-CACTD-SP1/BVM/SO4 2D CORD y 2D NCACX en 50 ms no muestran diferencias significativas en el cambio químico (Figura complementaria 3). Las asignaciones de desplazamiento químico (asignaciones intraresiduos/secuenciales) se realizaron de novo en las matrices cristalinas CACTD-SP1 utilizando numerosos conjuntos de datos de RMN de estado sólido de U-13C,15N-CACTD-SP1/BVM/SO4: 2D CORD, 2D y NCACX y NCOCX basados ​​en dipolar 3D, CONCA 3D y directo 2D basado en J: INADECUADO. Las asignaciones de desplazamientos químicos de la columna vertebral 15N y carbonilo 13C de los residuos en la cola SP1 se realizaron sobre la base de los espectros NCACX y NCOCX 2D de U-13C, 15N-CACTD-SP1/IP6 a baja temperatura (-37 °C y -79 °C). Las asignaciones de novo de las correlaciones entre residuos 13C-13C, 15N-13C se obtuvieron para U-13C, 15N-CACTD-SP1/BVM/IP6 utilizando espectros 2D CORD (tiempos de mezcla de 100, 250 y 500 ms) y 2D NCACX. (tiempo de mezcla de 50 ms) y PAIN-CP. Las correlaciones entre residuos de 13C-1H y 15N-1H se obtuvieron utilizando espectros HETCOR de CH y NH detectados con 1H, respectivamente. Sobre la base de todos los espectros, para 64 residuos se asignaron todas las resonancias de cadena principal y lateral de 13C y 15N y para 92 residuos se obtuvieron asignaciones completas de cadena principal. Para otros 28 residuos, se lograron asignaciones de cadena principal completa y cadena lateral parcial, y 6 residuos más tuvieron asignaciones de cadena principal y lateral parcial. Para 4 residuos, P147, R173, V181 y M245 (SP1-M14), no hay asignaciones de resonancia disponibles ya que los picos correspondientes faltaban debido a un desorden dinámico o se superponían con otras resonancias. Para 84 residuos, se completaron las asignaciones de protones de amida (HN) y, para 29 de ellos, también se obtuvieron asignaciones de protones de cadena principal (HN y Hα). Además, se asignaron sin ambigüedades múltiples desplazamientos químicos de protones de cadenas laterales de diversos residuos.

Las correlaciones de protones BVM e IP6 con resonancias de proteínas se asignaron en espectros 2D HC CP HETCOR, dREDOR-HETCOR y 2D (H)PH HETCOR de U-13C,15N,2H-CACTD-SP1/BVM/IP6 y U-13C,15N. ,2H-CACTD-SP1/IP6. Todas las muestras y sus condiciones experimentales se resumen en la Tabla complementaria 1. El número de picos cruzados asignados en varios espectros para cada muestra se resume en la Tabla 1. Los cambios químicos para CACTD-SP1 (matriz cristalina) se resumen en los Datos complementarios 1.

Las coordenadas iniciales de la molécula IP6 se ​​extrajeron de la estructura de rayos X del hexámero CTD-SP1 inmaduro del VIH-1 en complejo con IP6 (PDB: 6BHR)22, y las coordenadas iniciales de BVM se obtuvieron de ChemSpider (ID: 403003; 40,41 ambos grupos carboxilo fueron desprotonados.

Los parámetros iniciales del campo de fuerza de IP6 se ​​derivaron por analogía siguiendo el protocolo CGENFF42. Las penalizaciones por los parámetros y cargas IP6 derivados fueron todas inferiores a diez, lo que indica una buena analogía con los tipos de átomos disponibles presentes en CGENFF42. Por lo tanto, los parámetros IP6 CGENFF se utilizaron directamente en los cálculos de la estructura. Los parámetros del campo de fuerza de BVM CHARMM (Figura 16 complementaria) se derivaron utilizando CGenFF. Las cargas parciales y las interacciones vinculadas de BVM a las que se les asignó una puntuación de penalización superior a diez se refinaron en el nivel QM (Figura complementaria 16a). La evaluación de ajuste entre la superficie de energía potencial (PES) de QM y las superficies de Mecánica Molecular (MM) derivada de CGenFF también resultó en un error cuadrático medio (RMSE) considerablemente grande (Figura complementaria 16c). Esto implica que es necesario modificar parámetros problemáticos. Para la optimización de parámetros se utilizaron Force Field Toolkit M2.143 (FFTK) en VMD1.9.444 y Gaussian1645 en el nivel teórico MP2/6-31 G* y B3LYP/6-31 G*. Para modificar los parámetros del campo de fuerza de la mecánica molecular46 (MMFF) para toda la molécula, utilizamos el enfoque de fragmentación de la molécula42. Primero, BVM se dividió en tres fragmentos (fragmentos 1 a 3) para separar las regiones de alta penalización (Figura complementaria 16b). Sin embargo, uno de los fragmentos (fragmento 2) fue parametrizado por CGenFF sin puntuación de penalización, como se muestra en la figura complementaria 16b y, por lo tanto, para el fragmento 2, aceptamos el parámetro CGenFF sin ninguna modificación. Los átomos de carbono en los puntos de corte se taparon con grupos metilo para los fragmentos 1 y 3. La estructura molecular de estos dos fragmentos se optimizó utilizando Gaussian 1645. Después de la optimización de la geometría en el nivel teórico B3LYP/6-31 G*, el refinamiento de los parámetros procedió en tres pasos.

En primer lugar, las cargas parciales de los átomos en BVM se optimizaron basándose en datos QM en el nivel teórico MP2/6-31 G* para reproducir las interacciones de los enlaces de hidrógeno con una molécula de agua en varias orientaciones. Se construye un complejo para todos los donantes y aceptores de enlaces de hidrógeno que contienen una interacción de enlaces de hidrógeno entre una molécula de agua y los átomos de los fragmentos.

En segundo lugar, se utilizaron cálculos gaussianos de la arpillera para optimizar los parámetros de la longitud de enlace y los ángulos de enlace con puntuaciones de penalización altas en cada fragmento utilizando el espectro vibratorio escalado MP2/6-31 G*.

En el paso final, se realizaron exploraciones de ángulos diédricos para generar energía potencial PES en la superficie en el nivel teórico B3LYP/6-31 G*.

Al completar todos los cálculos gaussianos, los datos QM resultantes se utilizaron para modificar los parámetros MMFF utilizando FFTK43 en VMD44. Además, todos los parámetros se optimizaron según los datos objetivo de QM utilizando el algoritmo Downhill Simplex47. Posteriormente, se realizaron múltiples iteraciones utilizando datos QM, obtenidos de los pasos 1 a 3, para modificar cargas parciales, longitudes de enlace, ángulos de enlace y ángulos diédricos. En cada iteración, actualizamos el MMFF hasta que la superficie de energía potencial de la Mecánica Molecular (MM) de los ángulos diédricos se ajustó a QM PES con un RMSE relativamente bajo. Posteriormente, los parámetros del ángulo diédrico en cada fragmento produjeron ajustes agradables contra los potenciales QM, especialmente en regiones de energía potencial con menos de ~10 kcal/mol, como se muestra en la figura complementaria 16d-e, con RSME = 0,985 kcal/mol para el fragmento. 1 y RMSE = 1,065 kcal/mol para el fragmento 3. Los PES derivados de los escaneos conformacionales QM resaltan notablemente la precisión de todo el conjunto de parámetros, incluidas las cargas, la longitud del enlace, los ángulos de enlace y los ángulos diédricos42 (Figuras complementarias 16d-e) . Finalmente, los tres fragmentos se fusionaron eliminando los grupos metilo para obtener un único compuesto BVM. Los parámetros modificados con el método explicado anteriormente se muestran en la figura complementaria 17 y en las tablas complementarias 2-3.

Las restricciones de distancia se obtuvieron a partir de picos cruzados asignados en espectros de RMN MAS. Se consideraron restricciones tanto inequívocas como ambiguas; sin embargo, no se consideraron restricciones que excedieran 5 veces la ambigüedad. Las restricciones proteína-proteína fueron restricciones 13C-13C, 15N-13C, 15N-1H y 13C-1H. Las restricciones IP6 y BVM fueron restricciones 1H(IP6, BVM)-13C(proteína) y restricciones 31P(IP6)-1H(proteína).

Para el cálculo de la estructura de CACTD-SP1-V7A/BVM/IP6, la posición SP1-V7 se mutó computacionalmente a un residuo de alanina. Se utilizaron las restricciones de distancia entre residuos 13C-13C, 15N-13C y 15N-1H, junto con las restricciones de distancia intraresiduos 13C-13C, 13C-1H, 31P(IP6)-1H(proteína), que se obtuvieron de los espectros 2D CORD, 2D HC HETCOR y 2D (H)PH HETCOR de U-13C,15N,2H-CACTD-SP1-V7A/BVM/IP6.

Para todos los cálculos, los límites de las restricciones de distancia se resumen en la Tabla 2; estos se establecieron en 1,5-6,5 Å (4,0 ± 2,5 Å) y 2,0-7,2 Å (4,6 ± 2,6 Å) para restricciones intra e interresiduos, respectivamente, de acuerdo con nuestros estudios previos.48 Las restricciones diédricas Φ y Ψ fueron predicho a partir de TALOS-N49 utilizando los cambios químicos experimentales de 13C y 15N de los espectros de RMN MAS.

La estructura monocatenaria de CACTD-SP1 se calculó utilizando la distancia MAS NMR y restricciones diédricas utilizando Xplor-NIH versión 2.5350,51,52. Los cálculos de plegado se sembraron a partir de hebras extendidas de secuencia primaria. Se calcularon mil estructuras utilizando recocido simulado por dinámica molecular en el espacio del ángulo de torsión con dos programas de recocido sucesivos y una minimización del gradiente final en el espacio cartesiano. El cálculo de la estructura comenzó con una dinámica molecular a temperatura constante de 3500 K para el más corto de 800 ps u 8000 pasos con el tamaño del paso de tiempo permitido flotar para mantener la energía constante, dentro de una tolerancia. Las velocidades iniciales se aleatorizaron según una distribución de Maxwell utilizando una temperatura inicial de 3500 K. Después de este cálculo inicial de dinámica molecular, se realizó un cálculo de recocido simulado en el que la temperatura se redujo a 100 K en pasos de 25 K. A cada temperatura, la dinámica fue corra durante 0,4 ps o 200 pasos, lo que sea más corto. Las constantes de fuerza para las restricciones de distancia aumentaron de 10 a 50 kcal mol-1 Å-2. Las restricciones del ángulo diédrico se desactivaron para la dinámica de alta temperatura a 3500 K, pero se habilitaron durante el recocido simulado con una constante de fuerza de 200 kcal mol-1 rad-2. La constante de fuerza de volumen de giro53 se escaló geométricamente de 0,002 a 1. También se utilizaron la base de datos de ángulo de torsión54 y HBPot55. Después del recocido simulado, las estructuras se minimizaron utilizando un esquema de minimización de energía de Powell.

Posteriormente, se seleccionaron las 10 estructuras de menor energía para su posterior refinamiento, donde se refinaron 1000 estructuras en total. El recocido se realizó a 3000 K durante 10 ps o 5000 pasos, lo que se completó primero. El paso del tiempo de inicio fue de 1 fs y se autoajustó en pasos posteriores para garantizar la conservación de la energía. Las velocidades iniciales se aleatorizaron según una distribución de Maxwell utilizando la temperatura inicial de 3000 K. Posteriormente, la temperatura se redujo a 25 K en pasos de 12,5 K. En cada temperatura, el paso de tiempo predeterminado inicial fue de 1 fs y se realizó una dinámica de 0,2 ps. se realizó. Las constantes de fuerza para las restricciones de distancia aumentaron de 2 a 30 kcal mol-1 Å-2. Las constantes de fuerza de restricción del diédrico se establecieron en 10 kcal mol-1 rad-2 para dinámicas de alta temperatura a 3000 K y 200 kcal mol-1 rad-2 durante el enfriamiento. La constante de fuerza de volumen de giro53 se escaló de 0,002 a 1. También se utilizaron la base de datos de ángulo de torsión54 y HBPot55. Las estructuras recocidas se minimizaron utilizando un esquema de minimización de energía de Powell.

La estructura monocatenaria de menor energía calculada como se describe anteriormente se sometió a un acoplamiento de cuerpo rígido en la envoltura del hexámero de hexámeros. El acoplamiento se realizó utilizando un script interno de UCSF Chimera56 (consulte la Nota complementaria 1). Específicamente, en el mapa se identificaron 42 mejores posiciones (de 7 unidades de hexámero) para el acoplamiento de estructuras de cadena única, sobre la base de los valores de correlación cruzada más bajos y una breve inspección visual. Antes del acoplamiento, la densidad se preparó utilizando la rutina "molmap" en UCSF Chimera.

Después del acoplamiento, se realizó un cálculo para identificar la ubicación precisa de los ligandos IP6 y BVM, así como para incorporar restricciones de distancia adicionales entre cadenas y unidades de hexámero. El cálculo se sembró a partir de las coordenadas CACTD-SP1 de cadena única calculadas a partir de las restricciones experimentales de MAS NMR (ver arriba), junto con las coordenadas de BVM y/o IP6 generadas como se describió anteriormente. La ubicación de las moléculas dentro de un solo hexámero se estimó mediante inspección visual para permitir que las restricciones de distancia proteína-ligando se apliquen correctamente. Las coordenadas se ampliaron de un solo hexámero a una unidad de hexámero de hexámeros que contiene 7 hexámeros (42 cadenas) usando el comando symexp en PyMol57.

100 estructuras se sometieron a dinámica de ángulo de torsión con un programa de recocido y una minimización de gradiente final en el espacio cartesiano. La parametrización del campo de fuerza de las moléculas IP6 y BVM se incorporó a la ejecución mediante archivos de parámetros y topología, preparados específicamente para Xplor-NIH. Las moléculas BVM e IP6 tenían libertad para moverse como cuerpos rígidos durante la dinámica y la minimización final. Se realizaron dos corridas idénticas de recocido simulado a partir de 3000 K durante 10 ps, ​​con un paso de tiempo de 1 fs. Las velocidades iniciales se aleatorizaron para lograr una distribución de Maxwell a una temperatura inicial de 3000 K. Posteriormente, la temperatura se redujo a 25 K en pasos de 25 K. En cada paso de temperatura, la dinámica se ejecutó durante 400 fs con un paso de tiempo inicial de 1 fs.

Se utilizaron términos estándar para longitudes de enlace, ángulos de enlace y ángulos inadecuados para imponer la geometría covalente adecuada. Se utilizaron potenciales estándar para incorporar restricciones diédricas y de distancia.

Un potencial de distribución de probabilidad de correlación cruzada utilizado a menudo para la densidad crio-EM experimental58 impuso/concedió la forma general y el límite del hexámero de hexámeros con el mapa de densidad de 8 Å utilizado anteriormente para el acoplamiento. El potencial se restringió a los átomos de la cadena principal (N, C, CA y O) para garantizar que el límite de densidad no influyera en las conformaciones de las cadenas laterales.

Se empleó un potencial estadístico de ángulo de torsión54 y no se incluyó el término de volumen de giro para evitar conflictos con el potencial de densidad de correlación cruzada. Se utilizó un término de base de datos sobre enlaces de hidrógeno, HBPot, para mejorar las geometrías de los enlaces de hidrógeno55. Se impuso una simetría no cristalográfica aproximada utilizando el término PosDiffPot de Xplor-NIH, lo que permite que las subunidades del hexámero difieran hasta en 1 Å.

Las constantes de fuerza para las restricciones de distancia aumentaron de 2 a 30 kcal/mol·Å2. Las constantes de fuerza de restricción del diédrico se establecieron en 10 kcal/mol·rad2 para dinámicas de alta temperatura a 3000 K y 200 kcal/mol·rad2 durante el enfriamiento. Las constantes de fuerza del potencial de distribución de probabilidad de correlación cruzada se establecieron en 50 kcal/mol durante la dinámica de alta temperatura y el enfriamiento.

Después de la dinámica de alta temperatura y el enfriamiento en el espacio diédrico, las estructuras recocidas se minimizaron utilizando un esquema de minimización de energía de Powell en el espacio cartesiano. El paquete final de MAS NMR comprendía las cinco estructuras de menor energía de las 100 calculadas.

Los valores de RMSD se calcularon utilizando rutinas en Xplor-NIH (versión 2.51)50,51,52. Las visualizaciones de elementos estructurales se renderizaron por lotes en PyMOL utilizando scripts internos de shell/bash. Los elementos de la estructura secundaria se clasificaron según TALOS-N.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen del informe de Nature Portfolio vinculado a este artículo.

Las coordenadas de la estructura atómica de MAS NMR se han depositado en el Protein Data Bank con el código de acceso 7R7P (hexámero único de CACTD-SP1/BVM/IP6) y 7R7Q (hexámero único de CACTD-SP1/IP6). Los cambios químicos de MAS NMR se han depositado en el Banco de datos de resonancia magnética biológica con los códigos de acceso BMRB 30929 (CACTD-SP1/BVM/IP6) y BMRB 30930 (CACTD-SP1/IP6). La envoltura de hexámero de hexámeros de CACTD-SP1 utilizada en este estudio está disponible en el Protein Data Bank con el código de acceso 5I4T. Las coordenadas iniciales de la estructura IP6 utilizada en este estudio están disponibles en el Banco de datos de proteínas con el código de acceso 6BHR. En este documento se proporcionan los datos de origen para los ensayos de infectividad viral. Otros datos que respaldan los hallazgos del estudio, por ejemplo, scripts para cálculos de estructuras, análisis de resultados de cálculos y visualizaciones de estructuras, están disponibles a pedido de los autores correspondientes. Los datos originales se proporcionan con este documento.

El script UCSF Chimera para el acoplamiento por lotes de la estructura MAS NMR está disponible en la información complementaria.

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Este trabajo fue apoyado por las subvenciones de los Institutos Nacionales de Salud P50 AI1504817 (AMG y TP), 1U54 AI170791 (AMG, TP, BKG-P. y JRP), R01 AI129678 (BKG-P. y OP), P20 GM104316 y R01 AI157843. (JRP). Agradecemos el apoyo de la National Science Foundation (NSF Grant CHE0959496) para la adquisición del espectrómetro de RMN de 850 MHz y de los Institutos Nacionales de Salud (NIH Grant P30 GM110758) para el apoyo de la infraestructura central de instrumentación en la Universidad de Delaware; y de los Institutos Nacionales de Salud (NIH Grant S10 OD012213) para la adquisición del espectrómetro de RMN de 750 MHz en la Universidad de Pittsburgh. Se reconocen los recursos de supercomputadora DARWIN de la Universidad de Delaware.

Departamento de Química y Bioquímica, Universidad de Delaware, Newark, DE, 19716, EE. UU.

Sucharita Sarkar, Roman Zadorozhnyi, Ryan W. Russell, Caitlin M. Quinn, Hamed Meshkin, Juan R. Perilla, Angela M. Gronenborn y Tatyana Polenova

Centro de Pittsburgh para las interacciones entre proteínas del VIH, Facultad de Medicina de la Universidad de Pittsburgh, 1051 Biomedical Science Tower 3, 3501 Fifth Ave., Pittsburgh, PA, 15261, EE. UU.

Sucharita Sarkar, Roman Zadorozhnyi, Ryan W. Russell, Juan R. Perilla, Angela M. Gronenborn y Tatyana Polenova

Departamento de Fisiología Molecular y Física Biológica, Facultad de Medicina de la Universidad de Virginia, Charlottesville, VA, 22908, EE. UU.

Kaneil K. Zadrozny, Barbie K. Ganser-Pornillos y Owen Pornillos

Programa de Replicación y Dinámica del VIH, Centro de Investigación del Cáncer, Instituto Nacional del Cáncer, Frederick, MD, 21702-1201, EE. UU.

Alex Kleinpeter, Sherimay Ablan y Eric O. Freed

Departamento de Biología Estructural, Facultad de Medicina de la Universidad de Pittsburgh, 3501 Fifth Ave., Pittsburgh, PA, 15261, EE. UU.

Angela M. Gronenborn y Tatyana Polenova

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TP, AMG, BKG-P. y OP concibieron el proyecto y guiaron el trabajo. SS y RZ realizaron experimentos de RMN y analizaron los datos experimentales. KKZ preparó las muestras. RWR y SS realizaron los cálculos de la estructura. JRP diseñó y guió las simulaciones MD. HM y JRP parametrizaron los campos de fuerza para BVM. SS, RWR, RZ, HM y KKZ prepararon figuras para el manuscrito. RWR escribió scripts para cálculos de estructuras, análisis de resultados de cálculos y visualizaciones de estructuras. CMQ participó en el diseño o análisis de experimentos de RMN. EOF proporcionó polimorfos de secuencia viral A1V y V7A y comentarios críticos sobre el análisis de datos. AK y SA realizaron estudios de infectividad y unión a BVM de variantes resistentes a BVM. TP, AMG, BKG-P. y OP tomaron la iniciativa en la redacción del manuscrito. Todos los autores discutieron los resultados y contribuyeron a la preparación del manuscrito.

Correspondencia con Barbie K. Ganser-Pornillos, Owen Pornillos, Angela M. Gronenborn o Tatyana Polenova.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Nature Communications agradece a Ann McDermott y a los demás revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

Acceso Abierto Este artículo está bajo una Licencia Internacional Creative Commons Attribution 4.0, que permite el uso, compartir, adaptación, distribución y reproducción en cualquier medio o formato, siempre y cuando se dé el crédito apropiado a los autores originales y a la fuente. proporcione un enlace a la licencia Creative Commons e indique si se realizaron cambios. Las imágenes u otro material de terceros en este artículo están incluidos en la licencia Creative Commons del artículo, a menos que se indique lo contrario en una línea de crédito al material. Si el material no está incluido en la licencia Creative Commons del artículo y su uso previsto no está permitido por la normativa legal o excede el uso permitido, deberá obtener permiso directamente del titular de los derechos de autor. Para ver una copia de esta licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Reimpresiones y permisos

Sarkar, S., Zadrozny, KK, Zadorozhnyi, R. et al. Base estructural de la unión y actividad del inhibidor de maduración del VIH-1. Nat Comuna 14, 1237 (2023). https://doi.org/10.1038/s41467-023-36569-y

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Recibido: 05 de junio de 2022

Aceptado: 03 de febrero de 2023

Publicado: 04 de marzo de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-023-36569-y

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